降钙素基因相关肽衍生物的制备和降血压功能的研究-遗传学专业论文.docxVIP

复旦大学硕士学也论文中文摘要 复旦大学硕士学也论文 中文摘要 降钙索旗因相关肽(CORP)是人类首次应用基因工程方法发现的～种舒姐 管生物活性多肽。它在体内分布广泛，具有减慢心搴，降低搬压，扩张血管等功 能，怒目前体内已知的作用嫩强的舒血管物旗。本文尝试用基因工程方法构建 降钙素相关肽臻生物，著遁邀皂发性赢血压大鼠(SHR)来梭验CGRP衙生物 的降衄压作用。 (一)以pQE30势载俸翻备CGRP掰生物： pQE30是一个高效的表达质粒，其表达产物仑有6xHis tag，可利用食 “Ni甜”的浆和层析柱进行分离纯化。将CGRP基因克隆到载体pQE30的多克 隆位点处，擒建出～个瓶的袭达质牧pQE．CGRP：另夕}，分男4犍具有降血压功憨 的三个小肽 ： 心钠素(ANY)，His。His．Leu(HI-IL)和 Arg-Pro．Leu—Lys—Pro*Trp(RPLKPW)的基因悫隆到矮粒pQE—CGRP的CGRP基 因后，构建出三个表达质粒：pQE·CGRP-ANP,pQE—CGRP-3AA， pOE．CGRP一6AA。将以上4个震粒转化到大肠朽嫠M15中遴行表达，IPTG诱 导，j：页期获得4个带有CGRP的融含蛋白，经过发酵和Trieine小分子量电泳， Westem-blot检测，寒发现翳躲蛋白，原因可辘是蛋白分子量太小，表达量太低。 (--)以pGEX-4T．2为载体制餐CGl冲衍生物和降血压功能 的研究： 在上述实验的熬磁上更换载体淹pGEX-4T-2。pGEX载体会骞豁璇彗黢S。 转移酶(GST)基因，所表达的产物为带有GST的融合蛋白。利用PCR将带有蛋 自懿Factor-Xa酶切位点爨CGRP熬霆竟爨刘pGEX-4T-2豹GST纂嚣磊，褥 建成一个新的表达质粒pGEX—CGRP。另外也分别将三个小肽ANP，HHL， RPLKPW豹辇毽夷隆到CGRP基因惑，构建或三个赣黪袭速曩粒： pGEX．CGRP．ANP．pGEX．CGRP。3AA和pGEX．CGRP一6AA。将此四个表达质粒 转像裂大黥耪藿TGI遴行袭达，逶：；篷不月发酵瀑痰摹曩不嗣IPTG浓发熬选撵， 发现25℃，0．ImM条件下可获得搿表达的三个可溶性融合蛋白：GST-CGRP, GST-CGRP+3AA秘GST-CGRP-6AA。嚣囊毅pOEX．CGRP-ANP表达嚣寒发现 目的蛋白。经GST Sepharose 4B亲和层析纯化3个融合蛋白后，用BCA法测 定爨鑫浓覆。垮三令筑亿嚣豹熬台辍鑫分鬟对SHR送行生懿活毪梭溅，发现 三个融合蛋白均有～定的降庇压功能，其中GST—CGRP与GST—CGRP一6AA的 复旦大学硕士学位论文降压效果与标准品相似；而GST．CGRP．3AA的降压效果较为显著，尤其是对 复旦大学硕士学位论文 降压效果与标准品相似；而GST．CGRP．3AA的降压效果较为显著，尤其是对 舒张压，降幅能达60mmHg且维持时间长达70分钟以上。 关键词： 降钙素基因相关肽，衍生物，降血压 壅星奎堂婴主兰篁堡塞ABSTRACT 壅星奎堂婴主兰篁堡塞 ABSTRACT Calcitonin gene related peptide(CGRP)，with the function ofreducing heartbeat rhythm，decreasing blood pressure and strengthening systole，was found by genetic eng!neering methods first．It spreads in many tissues of the body．In this experiment， CGRP derivants were constructed and their anti—hypertensive activity was detected by injecting them into the spontaneously hypertensive rat(SHR)． (一)using pQE30 as vector to construct CGRP derivants pQE30 is a highly—expressed plasmid．The proteins expressed contain 6xHis tag．which Call．be purified by Affinity chromatography with‘Ni2+l’CGRP gene was cloned into the multiple cloning site ofpQE30 to obtain a new plasmid pQE—CGRP． Then another three peptid