胶原蛋白和骨架蛋白及钠氢交换抑制剂对糖尿病心肌病变的分析-内科学专业论文.docxVIP

中文摘要 中文摘要 目 的 研究糖尿病大鼠不同病程心肌胶原蛋白和骨架蛋白含量的变化，阐明 两者对糖尿病心肌病变发生的作用以及研究钠／氢交换抑制剂对糖尿病心 肌细胞钙超载的影响。 方 法 1．制造糖尿病大鼠心肌模型：体重250—3009Spraque—Daw|ey(SD)大 鼠36只，其中18只健康大鼠。18只经腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin， STZ，Sigma公司)60rag·Kg～，7天后测定血糖≥16．7mmol／L为糖尿病大 鼠。随机分为六组：糖尿病大鼠1个月组(DM 1)、糖尿病大鼠3个月组 (DM 3)、糖尿病大鼠6个月组(DM 6)和健康大鼠1个月组(C 1)、健康大 鼠3个月组(C 3)、健康大鼠6个月组(C 6)。每组大鼠各6只随机筛选入 实验。各组分别于糖尿病大鼠模型成功后1个月、3个月和6个月进行腹 腔内注射1．5％戊巴比妥(5rag·Kg“)进行麻醉后，打开胸腔，摘取心脏， 切取左心室4mm厚组织两块，将一份标本立即放入冻存管中，放入液氮中 保存，待测心肌羟氨酸含量；一份标本4℃10％福尔马林固定24h，PBS冲 洗，进行石蜡包埋，待测心肌细胞内胶原蛋白和转化生长因子B，(TGF— B，)及肌动蛋白含量。 2．测定心肌胶原总含量：以心肌羟氨酸水平来代表心肌胶原总含量。 以氯胺T法测定羟脯氨酸含量。称取冰冻左心室心肌组织100rag，网搓匀 浆后将组织粉末置于6M的HCL液2ml中125℃酸解5h，然后用6M的 NaOH液滴定至pH为7，然后2000r．min“离心10rain，取上清液l n11加柠 檬酸缓冲液0．5ml，再加O．05M氯胺T Iml，混匀氧化6 win；然后加3．15M 的过氯酸Iml，混匀放置5 min；再加10％对二氨苯甲醛lml80℃水浴6 rain，取出后冰水浴30 rain；最后一步UV一1206型分光光度计560hm处比 色测定。同时用l峭一lOv．g的羟脯氨酸标准品按上述相同步骤制作标准 曲线。对照标准曲线，求得羟脯氨酸含量，然后换算成每克心肌组织中羟脯 氨酸含量，再乘以7．46即得心肌胶原总含量。 3．心肌免疫组织化学染色：用于Collagen 3．心肌免疫组织化学染色：用于Collagen I、Collagen III、TGF一8，和 心肌型Q肌动蛋白(仅一actin)检测。采用石蜡切片，切片厚6p,m抗原染色 如下程序：(1)载玻片防脱片剂处理：选用Poly—Lysine。捞片后置烤箱 60℃30 min以使切片紧密粘附。(2)切片常规脱蜡至水。(3)蒸馏水新鲜 配置3％H20：，室温5 min一10 min以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。(4) 热修复抗原：将切片浸入0．01M枸橼酸盐缓冲液(PH6．O)，电炉或微波炉 加热至沸腾后断电，间隔5 min～10 min后，反复l一2次。冷却后PBS洗涤 1～2次。(5)滴加正常羊血清封闭液，室温20 rain。甩去多余液体，不洗。 (6)滴加1：100稀释一抗(小鼠或兔IgG)，4℃过夜。PBS洗2分钟×3次。 (7)滴加生物素化兔抗小鼠IgG，200C一37℃20 min。PBS洗2 min×3次。 (8)滴加试剂SABC，20℃～37℃20 min。PBS洗5 min×4次。(9)DAB显 色：使用DAB显色试剂盒。取1lnI蒸馏水，加试剂盒中A，B，c试剂各1 滴，混解剖学后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，约在30 min。蒸 馏水洗涤。(10)苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。显微镜观察。 4．采用显微图象分析仪(MetaMorph／DPl0／BXSl型)进行Collagen I、 Collagen III、TGF一8。和心肌型d—actin蛋白积分光密度分析，每组大鼠随 机取10～40个400倍显微镜视野图象，计算平均积分光密度(intergrated optical density，IOD)。 5．光镜标本的制备：石蜡包埋心肌标本切片，切片厚4v,m，做心肌胶 原MASSON染色。显微镜下观察心肌胶原分布。 6．透射电镜标本的制备：心肌标本用锇酸固定，PBS洗5 min x4，酒精 梯度脱水(30％、50％、70％)，丙酮梯度脱水(80％、90％、100％)。环氧树 脂浸透包埋，温箱聚合，超薄切片(70re)，透射电镜观察、摄片。 7．糖尿病鼠心肌细胞的培养：出生5天体重lOg一229Spraque—Dawley (SD)系鼠100只，经腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma公司) 60mg．Kg～，7天后测定血糖≥16．7mmol／L为糖尿病鼠，2周内存活18只 用于实验。实验动物空腹状态下，测定血糖≥16．7mmol／L，进行腹腔内注 射1．5