节杆菌产β半乳糖苷酶分离纯化及动力学参数分析-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

摘要 l111111|111|111111111lml| 摘要 Y1851932 协半乳糖背酶 (EC3.2.1.23) 是一种无毒无副作用的生物酶制剂，既能水解乳糖生成 葡葡糖和半乳糖，解决在约占-世界十分之一的人群中存在的乳糖不耐症问题;还能催化 转移半乳糖背反应，制备功能性低聚半乳糖和具有 l临床治疗功能的乳果糖。 本实验室分离得到一株产 β半乳糖背酶的节轩菌，该 β半乳糖背酶同时具有水解与 转背活性，本研究以分离纯化该酶并研究其酶学性质为目的。以乳糖发酵培养基培养节 杆菌，离心收集菌体，超声破碎细胞得到粗酶液:采用硫酸锻沉淀、 Phenyl-Sepharose 疏水、 DEAE-Sepharose 离子交换和p-aminobenzyl-l-thio 币。-galactopyranoside (PABTG) 亲和房析方法进行酶的分离纯化，纯化倍数达到 31.4，经SDS检测分子盘为 30 kDo 以邻硝基苯-a-D-P比喃葡萄糖背 (ONPG) 为底物，研究纯化后 β半乳糖背酶的酶学性 质，结果表明:该酶最适 pH 值为 6.6，最造反应温度为37 c ，pH 在 6.0-8.0 范围内稳 定性较好，相对酶活均在 80%以上，温度低于 30 C 时，相对酶活在 1 h 内保持在 50% 以上。 Mi+，Mn2+、Co2+、C对酶有显著的激活作用， cd\Ag+则有明显的抑制作用。 添加金属离子可以提高酶的热稳定性，尤其是 1 mmol/L的 M户，使酶在 45 C 时保持 60 min 酶活几乎没有损失。以 ONPG 为底物时测得 β半乳糖背酶的米氏常数为 4.64 mmol/L，最大反应速率为 0.919 阳lol/min 。 以乳糖为底物，研究纯化眉 β半乳糖背酶的水解能力，并通过高效液相色谱法 (HPLC) 分析产物中葡萄糖的含量，结果显示水解乳糖的最适条件:乳糖浓度为 3%，反 应温度为 30 C，反应时间为6- 8h，pH 在 6.5-7.0 时反应速率达到最大。 本文还研究了萨半乳糖背酶的转半乳糖背性质，以果糖为转背受体，采用高效液栩 色谱法测定酶反应产物中乳果糖的含量，进而分析该酶的转背活性，结果表明:转背的 最适温度为 20 c ，最适pH 为 6.00 关键词z 节杆酶 ;β半乳糖背酶;分离纯化;酶学性质:乳糖;乳果糖 H H Abstract Abstract pgalactosid附(EC3.2.l .23) is 也e bio-enzyme without ωxicity and side effects. It can catalyze lactoseωfonn glucose and galactose，or transfer the galacto脆 ω 由.e receptor saccharides to produce g叫-actooligosaccharides. 协galactosidase produced by Arthrobacter sp. has both hydrolysis and transgalactosyl activites. 白le purpose of this artic1e is to purify and ch缸a时创ze this en勾me.ηle culture bacterial cells were ga由.ered by centrifugation and disrupted by ultrasonication. The crude enzyme solution was precipi阳刚 by ammonium sulphate. Further enzyme purification w，部 carried out by Phenyl- Sepharose ，DEAE-Sepharose and p-aminobenzyl thio非Dgalacto pyranoside (PABTG) affinity chromatography.ηle purified 问alactosidase w:槌il1ustratedω a single band in SDS明白a purification fold of 31.4 and an app缸ent molecular weight of30 kD. When O-nitrophenyl-α-D.刨ucopyranoside (ONPG) w:制 used as substrate，the maximum activity of the ?-galactosid 制 W邸 detenn