降解肌酐为肌氨酸基因工程菌的构建-临床医学(内科学)专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 南华大学学位论文原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学 位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中 作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名： 年 月 日 南华大学学位论文版权使用授权书 本学位论文是本人在南华大学攻读硕士学位期间在导师指导下完成的学位论 文。本论文的研究成果归南华大学所有，本论文的研究内容不得以其它单位的名义 发表。本人同意南华大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位 论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可 以采用复印、缩印或其它手段保留学位论文；学校可根据国家或湖南省有关部门规 定送交学位论文。同意学校将论文加入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》， 并按《中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程》规定享受相关权益。同意授 权中国科学信息技术研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并 通过网络向社会公众提供信息服务。对于涉密的学位论文，解密后适用该授权。 作者签名： 年 月 日 导师签名： 年 月 日 4 万方数据 万方数据 降解肌酐为肌氨酸基因工程菌的构建 摘要 目的: 分别构建含肌酐水解酶及肌酸水解酶的重组质粒转化至大肠杆 菌中，研究其蛋白的表达及活性。 方法: 根据 GenBank 数据库已知的肌酐水解酶（恶臭假单胞菌 1978）及 肌酸水解酶（黄杆菌 U-188）的基因序列，由上海吉凯生物有限公司进 行生物合成，得到肌酐水解酶基因片段 a 及肌酸水解酶基因片段 b。根 据肌酐酶及肌酸酶的基因序列设计引物，PCR 扩增，进行双酶切,回收和 纯化，与质粒 GV296 酶切后进行连接，构建成重组质粒 GV296-a 及 GV296-b，分别转化至大肠杆菌 DH5a，筛选测序鉴定。提取重组质粒 GV296-a 及 GV296-b，转入至大肠杆菌 BL21（DE3），进行菌液 PCR 鉴定，得到表达工程菌 GV296-a/BL21(DE3)和 GV296-b/BL21(DE3),向 菌液中加入 IPTG 诱导其蛋白的表达，并制备粗酶液进行 SDS分 析。将工程菌 GV296-a/BL21(DE3)于含特定浓度肌酐的培养基中培养 24 小时，取培养液测定肌酐浓度；将工程菌 GV296-b/BL21(DE3)于含特定 浓度肌酸的培养基中培养 24 小时，取培养液测定肌酸浓度。 结果： 1.成功构建重组质粒 GV296-a 及 GV296-b，将上述重组质粒进行 双酶切，电泳显示目的片段大小分别约为 0.783Kb 和 1.212Kb，与理论 I 值符合。 2.重组质粒 GV296-a 及 GV296-b，转化至 E.coli BL21(DE3)感受态 细胞中，经 IPTG 诱导后实现高效表达。工程菌 GV296-a/BL21(DE3)表 达肌酐酶，具有肌酐酶活性，按基因序列图分析肌酐水解酶 261 个氨基 酸，经 SDS分 析 酶 蛋 白 的 分 子 量 约 为 29KD ，而工程菌 GV296-b/BL21(DE3)表达肌酸酶，具有肌酸酶活性，按基因序列图分析 肌酸水解酶 403 个氨基酸，经 SDS分析酶蛋白的分子量约为 43KD。 结论: 1.成功构建肌酐酶及肌酸酶的重组质粒，经双酶切及测序分析符合 理论值。 2.成功构建工程菌 GV296-a/BL21(DE3)和 GV296-b/BL21(DE3)，并 高效诱导肌酐酶及肌酸酶的表达，具有肌酐酶及肌酸酶活性。 关键词：肌酐水解酶；肌酸水解酶；基因工程菌 II RECOMBINE OF THE GENETICALLY ENGINEERED BACTERIA DEGRDNING CREATININE TO SARCOSINE Wanggun(Nephrology) Directed by Yangbo Abstract Obejective: The plasmid of containing creatinine and creatinase were constructed respectively and transformed into Escherichia coli,studying its expression and enzyme activity. Methods: According to the GenBank data known of creatinine(stench fake single cell bacteri