降钙素转基因的细胞学实验研究-骨外科专业论文.docxVIP

郑州大掌2005月《±Ⅻ究鱼毕m☆文(镕要) 郑州大掌2005月《±Ⅻ究鱼毕m☆文(镕要) 降钙景转#目的细胞掌实验研究 降钙素转基因的细胞学实验研究 硕士研究生 王秀利 导 师 王义生教授 李晓林副教授 郑州大掌第一附属医院骨科专业 邮 编450052 摘要 随着世界人口结构的老龄化，骨质疏松症已成为全球公众关注的公共卫生热 点，该病是以骨量降低和骨组织微细结构破坏为特征，导致骨脆性增加和容易发 生骨折的全身性疾病。该病的致残率和致死率较高，是一严重威胁老年人健康长 寿的多发病。原发性骨质疏松症患者血降钙素基础水平及储备功能均降低。降钙 素是一类天然肽类激素，它是目前治疗骨质疏松最有效的药物之一。目前临床使 用的降钙素主要是非人型降钙素，其来源有限、价格昂贵、且有弱的抗原性，限 制了长期使用。 基因治疗是将外源基因导入目的细胞并有效表达，从而达到治疗目的。骨质 疏松症的发病与多种基因相关，目前对骨质疏松症的基因治疗研究者不多，还多在 动物实验阶段，至今在国内外文献中尚未见以降钙素为目的基因来进行基因治疗 的研究报道。若能将基因治疗技术应用于骨质疏松症的治疗，将会有巨大的经济 效益和社会效益。本实验研究采用基因工程技术，构建降钙素表达载体，然后通 过脂质体转染方法将其降钙素基因导入靶细胞-NIH3T3细胞，获得降钙素基因持续 高表达的阳性克隆细胞株。 材料和方法： i．获得降钙素基因及其克隆 根据小鼠Ig Kappa分泌信号肽(Murine Ig Kappa Signal Peptide，MIKSP)和人 的降钙素(human Calcitonin，hCT)基因的序列，将其分成六个片断合成单链寡 核苷酸作为PCR的引物和cDNA合成的模板。扩增出小鼠IgKappa分泌信号肽和 郑州犬掌2005月m_士Ⅲ究生}＆论文(摘要) 郑州犬掌2005月m_士Ⅲ究生}＆论文(摘要) 降钙兰竺兰望竺竺竺竺墨兰兰查 降钙素的编码序列，即含小鼠Ig Kappa分泌信号的人降钙素基因。琼脂糖凝胶电 泳回收目的片段纯化后，将此段DNA插入到克隆载体pMDl8-T载体上。转化感 受态细菌JMl09，利用氨苄抗性筛选和蓝白斑筛选实验，筛选出阳性克隆，应用 双酶切和DNA测序鉴定重组质粒，命名为pMD 1 8-T-hCT。 2．构建人降钙素(human caleitonin， hcT)基因的分泌性真核表达载体 用HindlII着ll Xba I双酶切，将小鼠Ig Kappa分泌信号和人hCT基因从克隆载 体pMDl8-T载体上切下来，回收目的片段小鼠Ig Kappa分泌信号和人降钙素(hCT) 基因全长DNA，同时用HindlII和Xba I双酶切真核表达载体pcDNA3．0，回收双 酶切的真核表达载体，将经双酶切的小鼠Ig Kappa分泌信号和人降钙素(beT)基因 全长DNA定向克隆到真核表达载体pcDNA3．0中，筛选出阳性克隆，再应用双酶 切鉴定重组质粒，命名为pcDNA3，O-hCT。 3．降钙素基因在NIH3T3细胞的分泌表达 脂质体介导的转染和阳性克隆筛选、培养：用脂质体介导的转染方法，将重 组质粒转染细胞，用含G418的培养液进行筛选，2周后收集G418抗性细胞克隆， 继续在G418筛选下培养4周，按常规在细胞长满时消化、传代。 鉴定： 采用逆转录聚合酶链反应( reverse translation polymerase chain reaction，RT—PCR)：转染重组质粒后的抗G418细胞继续培养4周，收获细胞提取 总RNA采用两步法RT—PCR从mRNA水平上检测降钙素的表达。采用放射免疫法测 定降钙素在细胞培养液中的浓度，从蛋白水平来检测它的表达和表达效率。 结果： 1．获得了降钙素基因及其克隆 用动态模板PCR基因合成法合成含小鼠IgKappa分泌信号的人降钙素基因， PCR基因合成产物与pMDl8-T载体连接。筛选出阳性克隆经双酶切鉴定，获得了 插入212bp片段的转化子，测序结果与需合成的已知序列完全相同一致，命名为 pMDl8一T-hCT。我们成功的引入了三个酶切位点并且在3’末端成功的引入了一个 终止密码子。 2．构建了人降钙素(heD基因的分泌性真核表达载体 郑州大掌2005届Ⅵ±研究生毕m论^(摘要) 郑州大掌2005届Ⅵ±研究生毕m论^(摘要) 降钙素转基目的自胞掌实验研究 将经用HindIH和Xba I双酶切的小鼠Ig Kappa分泌信号和人降钙素(hCT)基因 全长DNA定向克隆到真核表达载体pcDNA3．0中，筛选出阳性克隆，再应用双酶 切鉴定重组质粒，命名为pcDNA3．0-hCT。 3．降钙素基因在NIH3T3细胞分泌表达 转染重组质粒后的抗细胞继续培养4周，收获细胞