结核杆菌耐利福平分子机制的研究及rpoB基因突变快速检测方法的探讨-内科学专业论文.docxVIP

结核杆菌耐利福平分子机制的研究及rpoB基因突变快速检测方法的探讨 结核杆菌耐利福平分子机制的研究及rpoB基因突变 快速检测方法的探讨 中文摘要 (由于耐药结核分支杆菌特别是耐多药结核菌的感染F1益增多，而利福平又 在结核病治疗中占有重要地位，因此，有关利福平的耐药机制及其耐药性的快速 检测一直是结核病防治工作中的研究热点。_ 本课题旨在对耐利福平结核分支杆菌的耐药谱进行分析，阐述利福平耐药 与耐多药之间的关系；随后对rpoB基因的核心突变区进行序列分析，研究rpoB 基因的突变特征及不同突变类型与利福平耐药性强弱之间的关系：同时根据反向 杂交原理，应用反向斑点杂交法检测rpoB基因的突变体，以探讨适合我国国情 的简便、快速的结核分支杆菌药敏测定方法。 f第一部分：结核分支杆菌的药敏测定及耐药谱分析 、’＼ 目的：分析结核分支杆菌的耐药谱，研究耐药结核分支杆菌对利福平耐药 与耐多药之间的关系。方法：收集58株结核分支杆菌，经过初步菌种鉴定后， 应用绝对浓度法测定结核分支杆菌对四种一线抗结核药物的药敏特性，并对耐利 福平结核分支杆菌的耐药谱进行分析。结果：58株结核分支杆菌中，利福平耐 药株36株，敏感株22株。36株利福平耐药株中，有32株至少对利福平和异烟 肼同时耐药，其比例高达88．9％，其中又有25株(25／32，78．1％)至少对另一 种一线药物如乙胺丁醇或链霉素耐药。结论：大部分利福平耐药结核分支杆菌同 时对异烟肼耐药，因此单独检测利福平的药敏特性即可初步筛选耐多药的结核分 支杆菌。 第二部分：结核分支杆菌rpoB基因的序列分析及其突变体的克隆 目的：对耐利福平结核分支杆菌rpoB基因的突变特点进行分析，同时研究 不同突变位点及同一位点的不同基因型与利福平耐药强弱之间的关系。方法：抽 提58株结核分支卡T菌的基因组DNA，对包含核心突变区的rpoB基因片段进行 PCR扩增和DNA测序，分析突变位点的比例、突变基因型及其与利福平耐药强 弱之间的关系：随后，对突变体的rpoB基因片段进行克隆。结果：36株耐利福 i严结核分支杆菌rpoB基因的核心突变区均存在突变，而22株敏感株术发现rpoB 膳因突变。所有突变均集中于rpoB坫凼69bp的核心突变区内，』∈涉及了6个弧 琏艘晰码f：．9个碱雎位点，13种突变膳凶型。53l位用I 526他衙鹏厂的总突变 率为72．2％，而且山这两个密码予突变所致的利福平耐药株多为高度I时药。结论： 率为72．2％，而且山这两个密码予突变所致的利福平耐药株多为高度I时药。结论： 结核分支卡丁菌rpoB基因的核心突变区发生突变是利福平埘药的主要原因t 531 位和526位密码子是耐利福平结核分支杆菌rpoB嬉因最主要的突变位点：而且， 结核分支杆菌rpoB基因突变位点与利福平耐药性的强弱程度之间具有一定的相 关性。 第三部分：结核分支杆菌rpoB基因突变快速检测方法的探讨 目的：建立适合我国国情的结核分支杆菌耐药株的快速检测方法。方法：根 据结核分支杆菌野生株序列，自行设计覆盖rpoB基因核心突变区的系列寡核苷 酸探针并将其固定在尼龙膜上，然后应用生物素标记的特异性引物扩增包含核心 突变区的rpoB基因片段，通过反向斑点杂交，对突变位点进行快速检测。同时， 选取部分不同突变位点和基因型的菌株应用INNO—LIPARif试剂盒进行检测，并 与反向斑点杂交法进行对比。结果：应用反向斑点杂交法检测36株耐药株和22 株敏感株rpoB基因常见突变位点，并据此判断其对利福平的药敏特性，结果敏 感性为88．9％，特异性为86．4％，药敏结果符合率为87．9％，而且与rNNO—LIPA Rif试剂盒的检测结果相比，判断药敏结果的准确率相近。结论：反向斑点杂交 法操作简便，可以快速检测rpoB基因的突变位点，进而早期判断结核分支杆菌 对利福平的药敏特性。与DNA测序和LiPA相比，该方法成本较低，易被我国 大多数临床实验室所接受。7 关键词： 结核分支杆菌； 利福平； 耐药： rpoB基因； 反向斑点杂交 中国图书馆分类法分类号：--R3-78．9I‘1：R52 Studies Studies on Mechanism of Mycobacterium Tuberculosis Resistance to Rifampin and Exploring oil Rapid Detectioil of Mutations in rpoB Gene Abstract The epidemic of drug—resistant Mycobacterium tuberculosis(M tuberculosis) especially the multiple—drug—resistant