结核分枝杆菌抗原肽类表位对人外周γδT细胞特异性激活的探讨-免疫学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 1 结核分枝杆菌抗原肽类表位对人外周γδ T 细胞特异性激 活的探讨? 中文摘要 研究背景：结核病（Tuberculosis, TB）的发生是结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）和宿主免疫细胞相互作用的一个复杂过程。机体对 Mtb 感染的 免疫机制和 TB 的发病机制并未完全阐明。近年来，具有天然免疫样作用的γδ T 细 胞在 Mtb 感染中的免疫作用，已得到众多研究者实验研究和临床观察的证实。然 而，对γδ T 细胞所能识别抗原的研究多集中于磷酸类抗原，有关肽类表位的研究 很少。但是，近期已有研究者报导γδ T 细胞识别人工合成多肽序列，本实验室近 期经噬菌体随机多肽展示库技术筛选获得γδ T 细胞识别的多肽序列，其人工合成 片段也可激活γδ T 细胞，证实了γδ T 细胞可以像 B 细胞一样直接识别多肽表位。 但γδ T 细胞是否也能识别 B 细胞所识别的表位，尚未见报道。基于此，本研究应 用多肽表位人工合成片段体外刺激培养人外周 PBMC 后用流式细胞术分析 Mtb-Ag 中 B 细胞表位多肽能否特异性刺激γδ T 细胞的活化和增殖，以寻找更多的γδ T 细 胞特异性表位多肽。也为抗 Mtb 感染的新型疫苗的研发提供一个新的方向。 目的：探讨 Mtb 抗原肽类表位能否特异性刺激γδ T 细胞。 方法：1. 根据文献报道，选取Mtb蛋白抗原中的6条B细胞表位多肽序列；以及本 实验室前期工作所得选取7条T细胞表位多肽序列，人工合成多肽片段。多肽人工 合成片段采用PBS稀释至1 mg/ml，过滤除菌后备用。 2. 将 B 细胞表位人工合成多肽片段包被在 ELISA 微孔板上，将健康人和结核患者 血清，以不同稀释度（1:3 和 1:9）加入微孔板中，加酶标二抗（羊抗人 IgG-HRP）， 洗涤后，再加底物显色，用酶标仪检测各孔显色的吸光度值（OD 值），并与阴性 孔对照和计算。 3. 将表位多肽作用于健康人 PBMC，计算其刺激人外周血 PBMC 后，γδ T 细胞的 增殖百分率；并利用 CFSE 染色技术观察γδ T 细胞增殖代数，检测表位肽对γδ T ????????????????本论文研究受国家科技重大专项课题（2008ZX10003-011）和蚌埠医学院研究生科研创新计 划基金项目（Byycx1303）的资助。 细胞的特异性活化增殖作用。 4. 收集各组培养的细胞，用荧光抗体进行细胞表面抗原染色，包括 CD3、TCRγδ、 Vδ1、Vδ2，流式细胞术检测，所得数据采用 Flowjo 软件分析。 5. 将表位多肽优势扩增出的γδ T 细胞，分两份，每份分成三组，分别以等量对应 多肽、不加多肽和等量无关多肽，刺激 18 小时后收取一份通过表面抗原染色，检 测表达 CD69 细胞的百分率；另一份加入 Mo（终浓度为 1 μg/ml）封闭 4 小时后， 收取细胞先表面抗原染色后再细胞内染色干扰素-γ（IFN-γ），检测表达 IFN-γ细胞 的百分率。 6. 将表位多肽优势扩增出的γδ T 细胞，通过 RT-PCR 技术得到 PCR 产物经过扫描， 分析各自的优势峰分布特点。 结果: 1. ELISA 结果显示 16 例健康人和 4 例结核患者血清以 1:3 和 1:9 的 稀释度，加入包被 B 细胞表位多肽的微孔板。其 OD 值（OD450）大于阴性对照(cut off value, COV) 2 倍，均可与 6 条 B 细胞表位多肽结合。可以证明从文献中选取的 6 条多肽是 B 细胞表位多肽。 2. 人外周血 PBMC 经 Mtb-Ag B 细胞表位 6 条多肽和 T 细胞表位 7 条多肽刺激培 养 12 天后，流式细胞仪检测和分析增殖细胞（CD3+、TCRγδ+）的百分率。用 Wilcoxon 符号秩检验将各组与阴性对照进行配对样本比较，发现 22 例γδ T 细胞增殖百分率 结果中 BP2（5.8）、BP3（6.2）、BP4（6.3）、BP5（6.3）、TP13（5.4）、TP14 （5.8）、TP15（5.6）、 TP16（5.8）和 Mtb-HAg（38.3）组与阴性对照（4.4）组 比较明显增高，差异有统计学意义（P 值分别为 0.008、0.044、0.007、0.049、0.044、 0.003、0.022、0.005 和 0.000）。 3. CFSE 标记的 PBMC 经上述表位多肽刺激培养 12 天后，流式细胞仪检测和分析 γδ T 细胞增殖（CD3+、TCRγδ+、CFSE-Low）的比例。用上述统计方法统计发现 7 例γδ T 细胞增殖指数在 BP2（3.9）、BP4（3.7）、BP5（4.2）、BP6（3.7）、TP14 （3.7）、