结核分枝杆菌19KD脂蛋白的提取及其对巨噬细胞活性和TLR-2受体影响的研究-病原生物学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 10 结核分枝杆菌 19KD 脂蛋白的提取及其对巨噬细胞活性 和表面 TLR-2 受体的影响* 中文摘要 巨噬细胞在控制结核分枝杆菌(简称结核杆菌)感染中起着重要作用。感染结核 杆菌后的巨噬细胞通过产生多种细胞因子、细胞凋亡、吞噬溶酶体融合等机制介 导杀灭结核杆菌，Toll 样受体(TLRs)的信号传导作用也为机体提供了重要的免疫保 护作用。结核杆菌表面成分十分复杂，侵入机体后它们可以作为配体被巨噬细胞 表面不同的特异受体所识别，为两者复杂的相互作用提供了基础。结核杆菌细胞 壁上分子量 19 KD 的蛋白(P19)是糖基化的脂蛋白，被认为是毒力因子之一。研究 发现 P19 可能是结核杆菌致巨噬细胞凋亡的诱导因子。通过提取结核杆菌细胞壁 上 P19，观察其对巨噬细胞表面 TLR-2 的影响，研究对细胞凋亡及细胞因子分泌 的作用，可以进一步明确结核杆菌的致病因子及致病机制，并且为疾病的预防和 治疗提供新的思路。 用改良苏通氏液体培养基大量培养结核杆菌，提取结核杆菌菌体蛋白；分子 筛析色谱法回收目的蛋白；SDS电泳，考马斯亮蓝R250染色，鉴定回收蛋白 分子量为19 KD；利用P19作为刺激信号，与佛波醇酯(PMA)分化的THP-1细胞建立 感染模型；流式细胞仪检测细胞凋亡情况；瑞氏姬姆萨染色(Wright-Giemsa stain) 镜检观察凋亡细胞形态；ELISA检测细胞因子分泌情况；MTT法检测P19对细胞活 性的影响；免疫细胞化学法(ICC)观察巨噬细胞表面TLR-2分布情况；对巨噬细胞 表面TLR-2进行荧光抗体染色，流式细胞术分析对照组与P19试验组TLR-2的表达 变化情况；激光共聚焦显微镜观察其受体排列在P19刺激前后有无变化。 结果发现：可以通过物理裂解法获得结核杆菌菌体蛋白，分子筛析色谱法回 收到纯化的 P19；5 μg/ml 的蛋白感染巨噬细胞 4 h 后细胞凋亡率为(13.12±1.84)%， 当 10 μg/ml 及更高浓度的 MtbP19 感染巨噬细胞时，随着浓度的增加，细胞凋亡率 逐渐增高，分别为(23.94±2.24)%、(43.29±3.20)%，空白对照组为(8.10±0.80)%；10 μg/ml 的蛋白感染巨噬细胞 2 h，4 h，8 h，24 h，48 h，凋亡率分别为(15.12±1.27)%、 *本课题受安徽省自然科学基金研究项目资助 (21.43±1.22)%、(29.78±1.50)%、(50.14±3.48)%、(67.83±3.46)%，均较空白对照组 ±1.71)%明显升高。方差分析 P0.01，说明 19 KD 脂蛋白能以时间和剂量依赖 方式诱导细胞凋亡；以 0.5 μg/ml、 1 μg/ml、2 μg/ml、4 μg/ml 剂量的 P19 刺激巨 噬细胞后，MTT 检测发现细胞的存活率分别为 78.1%、63.9%、66.3%、48.9%， 与空白对照组比较，各剂量的 P19 对巨噬细胞的活性有显著抑制作用，说明 Mtb P 19 能够抑制巨噬细胞的活性。 以 10 μg/ml 终浓度 P19 作用巨噬细胞 2 h，4 h，8 h，24 h，48 h。自 4 h 起 P19 刺激巨噬细胞产生 TNF-α和 IL-6 的量均高于同时段空白对照组细胞因子量 (P0.01)，说明 P19 可以诱导巨噬细胞 IL-6、TNF-α分泌增加。 ICC 法观察巨噬细胞表面 TLR-2 分布，DAB 染色后发现棕灰色颗粒均匀分布 于巨噬细胞表面，荧光抗体染色后流式检测发现：P19 作用组与对照组相比平均荧 光强度明显增强；同时 P19 短期诱导后的巨噬细胞爬片经抗 TLR-2-PE 荧光抗体染 色，激光共聚焦显微镜观察发现在细胞表面出现多个斑块状染色阳性的荧光标记 区，对照组 TLR-2 分子总体呈现随机动态的分布，说明 19 KD 脂蛋白不仅能诱导 巨噬细胞表面 TLR-2 表达的增加，还可以引起受体发生功能性聚集。 【关键词】结核杆菌；19KD 脂蛋白；细胞凋亡；细胞因子；Toll 样受体 English summary Macrophage plays an important role in the control of Mycobacterium tuberculosis (MTB) infection. Infected macrophage kills MTB through a variety of mechanisms such as phagocytosis lysosome fusion, cytokines, apoptosis. Toll-like receptors (TLRs) signal tran