结核分枝杆菌差异区RD6基因Rv1515c促进胞内存活及其分子机理研究-微生物学专业论文.docxVIP

研究生优秀毕业论文 独创性声明学位论文题目： 独创性声明 学位论文题目： 结趑金拉盘苴羞是区婴鱼基固BY!§!蔓曼堡进胞凼 盔适区甚金壬扭堡班窥 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了 特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁 在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者：／匀1钮犯 签字日期： 卅r年么月易日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院(筹)可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止)。 靴敝储群细舀 导师签名： 斯习 r、1q、l 日 日 签字日期：切伎年‘月占 签字日期：≯，步 万方数据 本文受教育部新世纪优秀人才资助计划(NCET-1 本文受教育部新世纪优秀人才资助计划(NCET-1 1_07∞)资 助，国家自然科学基金(编号N081271882，国家重要传染病科技重大专项结核病药物靶标 (2008ZXl 0003-006)、结核病诊断技术和产品 (2∞8ZXl 0∞3-001)、中央高校基本科研业务费专项资金结 核病控制工具源头创新研究(如J殷∞9A003)资助。 万方数据 目 目 录 摘要 I Abstract．．．． ．．． ．． ．．．． ．．．．．．．．．．．．．． ．．．．． ．．．．．． ．．．．．． ．．．．．．．．．．． ．．．．．．．． ．．．．．．．．．III 第1章综述 ．．1 1．1引言 l 1．2结核分枝杆菌特异性基因组区域RDs ．．1 1．3潜在特异性抗原———RDs编码蛋白 ．．2 1．4 RDs在分枝杆菌致病性中的研究 4 1．5展望 5 第2章前言 ．．7 第3章实验材料和方法 9 3．1实验材料 9 3．1．1实验菌株、载体和细胞 9 3．1．2主要试剂 9 3．1．3培养基和溶液的配制 9 3．1．4实验仪器设备 ．12 3．2实验方法 ．．12 3．2．1引物的设计与合成 12 3．2．2目的基因的获得 ．．13 3．2．3目的基因rvl515c的TA克隆 ．．13 3．2．4大肠杆菌DH5a、BL21和JMl09感受态制备及转化 ．14 3．2．4．1大肠杆菌感受态制备 14 3．2．4．2大肠杆菌的转化(热激法) 14 3．2．5 Ihl515c重组蛋白的表达 ．14 3．2．5．1 Rvl515c重组质粒的构建 ．14 3．2．5．2 Rvl515c重组蛋白在大肠杆菌中的表达 ．．15 3．2．6耻垢分枝杆菌感受态制备及转化 16 3．2．6．1耻垢分枝杆菌感受态制备 16 3．2．6．2耻垢分枝杆菌电转化 1 6 3．2．7重组蛋白在耻垢分枝杆菌中的表达验证(Western blot) 17 3．2．8重组耻垢分枝杆菌菌落形态观察 ．18 3．2．9滑动实验 。18 万方数据 3．2．10耻垢分枝杆菌生物膜培养 3．2．10耻垢分枝杆菌生物膜培养 ．18 3．2．11重组耻垢分枝杆菌脂肪酸分析 一18 3．2．12重组耻垢分枝杆菌在营养饥饿条件以及酸性条件下的存活影响 19 3．2．13重组耻垢分枝杆菌对SDS耐受性检测 ．．19 3．2．14重组耻垢分枝杆菌对氧化压力的影响 20 3．2．15重组耻垢分支杆菌侵染巨噬细胞(RAW264．7和THP．1)后胞内 存活率及细胞因子检测 ．20 3．2．15．1巨噬细胞培养 ．20 3．2．15．2重组耻垢分枝杆菌菌悬液的制备 21 第4章结果与分析 25 4．1 rvl515c目的基因扩增和鉴定 一25 4．2成功构建Rvl515c大肠杆菌表达菌株 25 4．3 Rvl515c重组蛋白在大肠杆菌BL2l中成功表达 26 4．4成功构建重组耻垢分枝杆菌MS Rvl515c ．27 4．5重组耻垢分枝杆菌MS Rvl515e菌落形态观察和生物膜形成 ．27 4．6 Rvl515c对耻垢分枝杆菌生长无显著影响 ．．28 4．7滑动实验 一29 4．8重组耻垢分枝杆菌脂肪酸含量检测 ．29 4．9 Rvl515c增强耻垢分枝杆菌在营养饥饿及酸性条件下的存活 30 4．10 Rvl515c增强耻垢分枝杆菌对SDS的耐受 3l 4．1 1 Rvl515c增强耻垢分枝杆菌对H202的耐受 一3 l 4．12 Rvl51