结核分枝杆菌干扰巨噬细胞自噬的初步研究-预防兽医学专业论文.docxVIP

华中农业大学2016届硕士研究生学位论文3．2．7 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文 3．2．7 CRISPRi／CⅪSPRa系统的构建 ．19 3．2．8细胞基因组的提取 20 3．2．9 Western Blot实验 ．20 3．2．10以氯化钙法制备感受态细胞 毫 3．2．1 1相关引物的设计及合成 ．季 3．2．12常规分子克隆实验 玛 第四章技术路线 ．28 第五章结果和分析 ．29 5．1结核分枝杆菌H37Ra表达CFP菌株的构建与鉴定 29 5．1．1 CFP重组表达质粒的构建 一29 5．1．2 H37Ra的BFP／CFP荧光表达菌株的鉴定 29 5．2双荧光巨噬细胞系的构建及验证 30 5．2．1 G418工作浓度的筛选 ．．30 5．2．2 CRISPR相关剪切质粒的构建 31 5．2．3 EGFP基因序列的改造 31 5．2．4同源重组片段的克隆 32 5．2．5稳定转染细胞系的构建及初步筛选 ．32 5．2．6细胞系GFPph．mCerry．LC3融合蛋白表达检测 34 5．2．7细胞系指示自噬的功能验证 一34 5．3干扰自噬相关结核蛋白的筛选 35 5．4鼠源自噬基因gRNA文库的构建 36 5．4．1 CRISPRi／CRISPRa系统功能验证 ．36 5．4．2相关鼠源自噬基因的筛选及gRNA设计 ．37 第六章讨论与结论 ．39 6．1青色荧光结核分枝杆菌的构建 39 6．2双荧光巨噬细胞系的构建 ．40 6．3结核蛋白Rv0847对自噬的干扰的初步研究 ．41 6．4结{仑 一41 参考文献 42 致谢 52 万方数据 结核分枝杆菌干扰巨噬细胞自噬的初步研究摘要 结核分枝杆菌干扰巨噬细胞自噬的初步研究 摘要 由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)引起的结核病是世界上 最严重的细菌性疾病之一。尽管宿主细胞存在着多种清除结核分枝杆菌的策略， 但结核分枝杆菌也进化出了对抗宿主细胞杀伤作用的生存机制。研究表明，细胞 自噬与结核分枝杆菌的相互斗争，是影响该菌能否在宿主细胞中生存的重要因 素。然而，参与这一过程的细菌和宿主相关基因仍未得到详细的阐释。 本研究以结核分枝杆菌作为研究对象，通过构建青色或蓝色荧光表达菌株和 双荧光指示自噬的巨噬细胞系以及一套能够抑制和激活真核基因表达的 CⅪSPRi／C对SPRa系统作为研究工具，以此来揭示调控结核分枝杆菌在宿主细 胞中存活的相关基因。主要研究内容如下： 1．青色／蓝色荧光结核分枝杆菌H37Ra的构建。为了方便利用荧光显微镜 对结核分枝杆菌的直接观察，我们将能够表达青色或者蓝色荧光蛋白的 pMV261．CFP／BFP质粒导入到结核分枝杆菌H37Ra中。通过筛选，得到了能够 稳定表达青色或蓝色荧光的结核分枝杆菌。 2．双荧光指示自噬的巨噬细胞系的构建。首先，我们将EGFP基因突变为 GFPph使其对pH环境更加敏感，并与mCherry和LC3基因进行串联表达。之后， 利用CRISPR／Cas基因编辑技术，将GFP。h．mCherry．LC3融合基因插入到 Raw264．7细胞基因组中。通过多轮的挑斑筛选以及流式技术的纯化，我们获得 了高阳性率的G。hML．Raw264．7细胞。通过对基因组的测序以及WesternBlot技 术验证相关蛋白的表达，确认细胞系的构建成功。最后，利用自噬诱导剂进行验 证，确认该细胞系可以有效地指示自噬的发生。 3．结核分枝杆菌蛋白对自噬干扰的分析。为了探究哪些细菌蛋白通过干预 自噬而参与调控结核分枝杆菌长期潜伏于巨噬细胞，我们将经过密码子优化的 33个结核相关蛋白与G。hML．Raw264．7细胞进行共孵育，通过雷帕霉素诱导自噬 发生，在特定时间点利用激光共聚焦显微镜分析自噬的发生状况。结果发现 Rv0847处理细胞中绿色荧光点与红色荧光点可以共定位，说明Rv0847可以干扰 自噬体与溶酶体的融合。以上结果说明Rv0847可能干扰自噬溶酶体的融合，从 而参与结核分枝杆菌在细胞内的存活。 万方数据 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文4．宿主自噬基因gRNA文库的构建。利用C砒SPIWCⅪsPRa技术，我们 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文 4．宿主自噬基因gRNA文库的构建。利用C砒SPIWCⅪsPRa技术，我们 可以在真核细胞基因组上抑制或者激活基因的表达。我们将该系统及相关质粒转 染293T细胞，结果显示其可有效地激活或者抑制相关基因的表达。之后，我们 筛选了所有参与到自噬过程中的相关基因，并通过NCBI获取基因附近的所有序 列信息。通过在线分析软件获取最佳gRNA序列。将得到的gRNA序列分别插 入到CRISPRi和CRISPRa质粒中，得到关于宿主自噬基因gRNA的文