结核分枝杆菌喹诺酮耐药基因功能研究-病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

四川大学博士论文 四川大学博士论文 结核分枝杆菌喹诺酮耐药基因功能研究 结核分枝杆菌喹诺酮耐药基因功能研究 博士研究生：赵明才 导师：鲍朗教授 中文摘要 结核病是由结核分枝杆菌引起的一种世界性传染病，近年来随着人 口流动增加、HIV与结核分枝杆菌伴发感染以及结核分枝杆菌多重耐药 性菌株的出现等原因，使全球结核病疫情再度回升，其中耐药菌株的出 现是治疗失败的主要原因。结核分枝杆菌由于其特殊的细胞壁结构，对 多种药物有天然的耐药性，耐药机制复杂。1998年，Cole等发布了结核 分枝杆菌H37Rv全基因测序结果，使人们能从基因水平研究结核分枝杆 菌的耐药机制。 随着耐多药结核分枝杆菌感染的出现，人们期待更加有效的药物出 现，从而把更多的目光投向了=线药物，其中喹诺酮类药物尤其受到青 睐。喹诺酮类药物为一类全合成的抗菌制剂，自1962年发现了奈啶酸 (Nalidixic acid)以来，已有四代喹诺酮类药物上市，但只有第三代的 喹诺酮类抗菌药具有抗分枝杆菌活性。喹诺酮类药物主要作用于结核杆 菌DNA促旋酶，该酶由A、B亚单位组成，药物韵耐药性主要由予作用靶 位的改变，A亚单位突变常常导致高耐药，B亚单位突变常常导致低耐药， 而有的低水平的耐药常常缺乏喹诺酮类药物靶位的改变，有时高水平的 耐药又不能单一地用靶位的改变来解释，所以还有其他的耐药机制的存 在。随着喹诺酮类药物的广泛使用，耐药菌株也日渐显现，严重影响其 疗效和临床应用。研究喹诺酮耐药产生机制，就具有重要意义。 本研究利用生物信息学的方法对结核分枝杆菌全基因组进行分析发 现，结核分枝杆菌基因组中大约有20种外排蛋白编码基因，其中多数与 四川大学博士论文 四川大学博士论文 结核分枝杆菌喹诺酮耐药基因功能研究 耐药有关，并提示Rv2994基因与氟喹诺酮类药物的外排很可能相关。为 明确Rv2994基因的功能，首先，我们将该基因1338bp片段首次从基因 组中扩增出来，并在原核融合表达载体pGEX一1 x T中成功表达了GST --Rv2994融合蛋白，免疫新西兰大白兔，制各了高效价的多克隆抗体， 为研究该基因功能奠定了基础；其次，将Rv2994基因片段通过穿梭表达 载体pMV261经电转化重组入无毒耻垢分枝杆菌mc2155，并在重组耻垢 分枝杆菌中成功表达了约47KDa的Rv2994基因编码蛋白，将耻垢分枝 杆菌、pMV261重组耻垢分枝杆菌和pMV-2994重组耻垢分枝杆菌分别 接种于含有不同浓度的喹诺酮类药物的2×YT培养基中，检测MIC，同 时利用荧光分光光度计检测三种耻垢分枝杆菌在不同时间的体内药物累 积浓度，初步判定细菌的稳态浓度及达到稳态浓度的时间，接着使用能 量解耦合剂CCCP处理后再次检测上述指标，综合生物信息学分析结果 判断Rv2994基因编码蛋白的功能及外排泵性质；最后，对四川地区结核 分枝杆菌喹诺酮耐药基因的突变进行了研究，发现结核分枝杆菌耐喹诺 酮与gyrA基因突变密切相关，gyrA基因突变是耐喹诺酮结核分枝杆菌 耐药性的主要分子机制，但可能还有其他的耐药机制。 本研究首次证实Rv2994基因的编码产物是～种药物外排泵，氧氟沙 星是其作用底物，该外排功能能被CCCP阻断，表明其转运药物是依赖于 质子梯度的耗能过程，同时证实四川地区耐喹诺酮结核分枝杆菌临床株 也以gyrA突变为主，但存在其他机制，可能也有外排机制的参与。Rv2994 是否参与了多耐药的形成机制，还有待进一步研究。 关键词：结核分技杆菌：Rv2994基因；药物外排泵； 重组耻垢分枝杆菌 ’本课题为国家自然基金资助项目(批准 四川大学博士论文 四川大学博士论文 结核分枝杆菌喹诺酮耐药基因功能研究 Characterization of a quinolone-resistant gene of Mycobacterium Tuberculosis Doctor student：Zhao Mingcai Tutor：Prof．Bao Lang Abstract Tuberculosis is the worlds leading eause of mortality owing to an infectious bacterial agent，Mycobacterium tuberculosis．The HIV／AIDS pandemic has been attributed to the global resurgence of TB，with increased mobility owing to mass movement of population and the eme唱ence of multidrug-resistant slxains of Mycoba