结核杆菌Hsp65与EGFP融合基因的构建及树突状细胞疫苗的制备-免疫学专业论文.docxVIP

中文摘要 研制开发有效的新型抗结核疫苗 F 是当前结核病研究的主要目标。树突状细胞 (DC) 表面具有高密度的抗原递呈分子和共剌激分子 F 能剌激初始型(na?ve)T 细胞大 量活化增殖。分枝杆菌日sp65 蛋白(热休克蛋臼)作为免疫优势抗原 F 能诱导和增强机 体的抗结核免疫应答。我们用含有增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 报告基囚的质粒 pEGFP-Cl 作为载体，用结核杆菌 H37Rv 株 Hsp65 DNA 为目的基因 F 构建重组质粒 pEGHsp65 ，以其转染真核细胞9 观测蛋白表达。再将其导入 DC 中?制备新型抗结核 的 DC 疫苗。 本研究根据结核分校杆菌基因序列，设计一对 PCR 引物，以人型结核杆菌 H37Rv 标准毒力株的总 DNA 为模板 F 经过 PCR 循环扩增出 Hsp65 目的基因p 将囡收的 PCR 产物和载体 pEGFP...Cl 用限制性核酸内切酶 BglII 、EcoR 1双酶切费再用几 DNA 连接 酶连接 F 筛选得到的 pEGHsp65 阳性克隆经酶切鉴定和 DNA 测序鉴定。用质脂体方 法将重组质粒转染入真核细胞(人宫颈癌细胞 Hela 细胞)，在共聚焦显微镜下观测荧光 表达强弱，以调整优化转染条件。分别收集 pEGHsp65 、pEGFPCl 质粒转染的 Hela 细胞 F 提取总则叫A 进行逆转录得到 cDNA ，将其作为模板步加入Hsp65 特异性引物进 行 PCR 测定 F 并在 PCR 反应体系中补加内参 (βactin) 引物作为对照。无茵取小鼠骨髓 细胞，加入细胞因子 nnGMCSF、rmIL-4 培养，第 8d 收集细胞分别用光镜和电镜对 诱导的 DC 进行形态学鉴定。将空载体质粒和重组质粒分别转染入 DC 中，同时设立 未转染的细胞对照组会转染 48 h 后在共聚焦显微镜下观测荧光表达的强弱。用 MTT 比色法检测。c 疫苗剌激小鼠米致敏脾细胞的增殖。 结果显示:重组质粒 pEGHsp65 经 BglII 、EcoR 1 双酶切鉴定和 DNA 测序鉴定证 实 H37Rv 株 Hsp65 DNA 己插入重组表达载体 pEGFPCl 中:将重组质粒转染入 Hela 细胞， 24 h 即可观察出转染细胞有荧光蛋白的表达， 48 h 表达荧光蛋白的细胞数最多， 培养 72、96 h 表达荧光蛋白的细胞数有所下降，强度减弱; RT-PCR 检测到重组质粒 转染的细胞中有 Hsp65 mR1、认的表达:光镜和电镜对诱导的 DC 进行了形态学鉴定。 用 MTT 比色法检测到 DC 疫苗能引起未致敏脾细胞增殖。 本课题初步完成了结核杆菌 Hsp65 与 EGFP 融合基因的构建及 DC 疫苗的制备 。 为进一步观察其治疗结核病的效应奠定了基础。 关键词:结核杆菌: Hsp65; 增强型绿色荧光蛋白:树突状细胞: 11 Abstract Currently the main target ?f Mycobacterìwn tuberculosis research ìs to construct new effe-tive anti-tuberculosis vacc?ne. There are high ?ntensity antigen presenting nloleculars， co-stimulate moleculars on the surface of dendritic cells which can stimulate the activation and pro1iferatìon of n刽ive T cel}s. Hsp65 (heat shock proteins) lS a prominent antlgen lD triggering and enhancíng immune response to tuberculosis. Mycobacterium tuberculosis H37Rv Hsp65 DNA was cloned into eukaryotíc expression vector pEGFP‘Cl to construct recombinant plasmid pEGHsp65. Then pEGHsp65 was 位ansfected ínto Hela cells and Hsp65 proteín expression was detected. Recombinant plasmid was transfected sequently into dendritic ?ells to CQnstruct antituberculosis