结核杆菌抗原CFP21的CTL表位筛选与改造-细胞生物学专业论文.docxVIP

例143仰241 原创性声明 本人郑重声明:所是交的学位论文，是本人在导师的指辱下，独立进行研 究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 就集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者:胁L 日期: v年 f 月习日 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部 门成机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅:本人授权郑州 大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印威者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学 位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑 州大学.保密论文在解密后应遵守此规定。 学位的作者 z 见如 中文摘耍 结核杆菌抗原 CFP21 的 CTL 表位筛选与改造 摘要 结核病( Tuberculosis ，TB )是由结核轩菌(均Icobacterium tuberculosis ， M由)引起的一种慢性传染病，目前仍然是导致传染病发病革和死亡率较高的 疾病之一.尤其是近年来，由于人体免疫缺陷病毒双重感染的出现而造成个体 机会性感染愈发严重。目前唯一可用的用于结核病预防的疫苗是卡介苗 (Baci1lus Calmette Guérin ，BCG) ，但其在预防成年人忠肺结核的有效性方面 受到了限制，并且伴随着结核杆菌多建耐药菌株的出现，人们迫切需要研制新 型的抗结核疫苗。 由 CD4+ 辅助性丁(Thl)细胞和 CD旷毒性丁淋巴细胞 (CTL) 所介导的 细胞免疫反应在抗结核感染保护性免疫中发挥着主导作用。结核新型疫苗的研 究依赖于能被 CDS+ T 细胞识别从而产生 IFN-y而发挥杀伤效应的结核抗原 及其相应表位的鉴定。分泌蛋白以及细胞壁蛋白是结核轩菌主要的免疫保护抗 原，并且位于 Mtb 基因组和 BCG 差别区(阳区〉内的分泌蛋白由于其在 BCG 中的缺失，逐渐成为疫苗候选抗原的热点，优势抗原表位的鉴定，对发展 更有效的结核病治疗性多表位肤疫苗具有重要的意义，并且能够为基础研究提 供理论基础。 结核轩菌分泌蛋白 CFP21 (c叫阳re filtrate pro阳ins 21 ，培养滤液蛋白21)位 于朋2 区，具有高度的免疫原性。 CFP21 能够诱导结核感染结核患者产生 T 细胞增殖反应以及释放高水平 IFN币发挥细胞杀伤作用，是抗结核疫苗设计 的理想候选抗尿。 CFP21 日LA-A*020 1103 限制性表位的鉴定与改造主要通过以下工作来完 成z 我们首先运用在钱数据库，以 SYFPEITHI 初步预测，结合 BIMAS 和 NetCTL 1.2 在线分析，初步筛选出一系列的天然表位肤.日有相关文献报道， 通过对抗原农位铺定位点的氨基酸替换，能够增强农位与 HLA- 1分子的结合 力.因此，我们通过将天然表位，按 lY、2L 和/或 9L 进行氨基酸贵换，获得 中文摘要 改造肤，利用数据库再次分析，以期寻求结合力更高的表位。综合分析预测结 果，选取在至少两种数据库中评分结果位于前 10 的表位肤，分别是 4 条母体 肤 p5 (SLVRIVGVV) 、p13 (VVTlπLALV) 、p134 (AVADHVAAV) 、p189 (NIMAHVSYV )以及 3 条改造肤 p189-1Y2L9L (YLMAHVSYL) 、p134-1Y江 (YLADHVAAV) 、p134-1Y2L9L (YLADHVAAL)o 对已经筛选出来的表位， 我们采用标准 Fmω 方案合成多肤，产物经反向高效液相色谱 (RP-旧LC) 分 析、纯化，获得了纯度高于 95% 的九肤产物。经质谱测定，分子最所得测定值 与理论值相符合。 通过内源性抗原提显途径中所必需的抗原多肤转运蛋白 (TAP) 缺陷的T2 细胞结合力以及肤 /HLA 稳定性实验，对初步筛选的表位进行验证。结果显示， 相对于母体肤 p134 ，改造肤p134-1Y2L p134-1Y2L9L 与 HLA 分子具有更 高的结合力与稳定性。通过结合力及稳定性的初步筛选，在?条候选肤中，只 有母体肤 p134 以及相应的两条改造肤，用于后续 ELISPOT 以及细胞毒杀伤 作用的丁细胞免疫活性检测。通过皿 A-A*0201+ PPD+/ HLA-A*03+ PPD+ 健康 供者外周血单核细胞 (PBMCs) 诱导出能够分泌 IFN-y的细胞数的分