结核分枝杆菌孤儿反应调节因子Rv0818基因缺失株的构建及功能的初步研究-预防兽医学专业论文.docxVIP

华中农业大学2016届硕士研究生学位论文4．1．4基因缺失株PCR-鉴定 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文 4．1．4基因缺失株PCR-鉴定 ．．30 4．2兔抗Rv0818多克隆抗体的制备 31 4．2．1 Rv0818原核表达菌株的鉴定 ．31 4．2．2 Rv0818．his蛋白的纯化 3l 4．2．3兔抗Rv0818多克隆抗体检测 ．32 4．3 Rv0818缺失株表型实验 。33 4．3．1菌落形态学观察 ．．33 4．3．2 NO杀伤实验 33 4．3．3胞内存活实验 。35 4．3．4荧光定量PCR 一36 5讨{仑 37 5．1结核分枝杆菌基因缺失平台的构建 ．37 5．2 Rv0818多克隆抗体的制备 37 5．3缺失株表型实验 ．38 6结{仑 40 参考文献 4l 致谢 49 lI 万方数据 结核分枝杆菌孤儿反应调节因子Rv0818基因缺失株的构建及功能的初步研究摘要 结核分枝杆菌孤儿反应调节因子Rv0818基因缺失株的构建及功能的初步研究 摘要 结核分枝杆菌在巨噬细胞中生存需要面对多种极端的环境，如缺氧、一氧化氮 杀伤、营养缺乏等等。双组份调节系统对于结核分杆菌在这些极端环境中存活至关 重要。目前对于双组份调控系统孤儿反应调节因子Rv0818的功能及上游信号研究 较少。本实验利用温敏性噬菌体介导的结核分枝杆菌敲除方法构建了Rv0818单基 因缺失株。通过比较缺失株与野生株在固体平板上形态学特征、对于一氧化氮的耐 受以及在巨噬细胞中的存活情况，观察Rv0818缺失对结核分枝杆菌的影响。并通 过检测Rv0818下游基因表达量变化，验证了Rv0818作为转录调控因子的作用。本 实验为结核病致病机理的研究提供了实验基础，同时给结核疫苗的研制提供了备选 的基因缺失菌株。 1结核分枝杆菌基因缺失株的构建与鉴定 实验成功将Rv0818同源重组区域插入到分枝杆菌噬菌体中，并利用噬菌体感 染结核分枝杆菌得到了能在Hyg抗性平板上生长的阳性克隆子。通过PCR鉴定和测 序鉴定确定了目的基因被抗性区域替换，成功构建了结核分枝杆菌基因缺失株。 2形态学特性比较 实验比较了野生株与突变株在固体平板上的形态学特征。结果显示缺失株在固 体平板上生长形成更少的索状结构，而索状结构的形成与菌株的个体大小、生长速 率以及细胞壁外层结构密切相关，预示着Rv0818缺失株毒力的减弱。 3 NO耐受能力的比较 实验比较了野生株和缺失株在NO刺激条件下的生长情况。结果显示野生株与 缺失株的生长会受到高浓度NO的抑制。而野生株能够更快从NO抑制作用中恢复， 说明Rv0818的缺失影响了菌株对环境的适应能力。 4胞内存活能力的比较 实验比较了巨噬细胞对野生株与突变株的吞噬率，结果显示缺失株更容易被巨 噬细胞吞噬。实验还比较了菌株在感染细胞后24h、48h、72h的存活情况。结果显 示缺失株在胞内活菌数基本不变，而野生株活菌数在感染72h时增加了3倍，说明 Rv0818的缺失使菌株在胞内的存活能力下降。 5 Rv0818下游基因表达量变化 实验比较了Rv0818缺失时部分基因表达量的变化。结果显示Rv0818缺失后， NO耐受相关基因的表达量显著上升，同时代谢相关基因表达量显著下调，验证了 Rv0818对这些基因的调节作用。 6兔抗Rv0818多克隆抗体的制备 实验制备了兔抗Rv0818多克隆抗体，并通过Western Blot验证了其使用效果， 结果显示该抗体可以用于舢818后续功能的研究。 关键词：结核分枝杆菌：孤儿反应调节因子：Rv0818：GlnR；基因缺失：NO 耐受 万方数据 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文Abs仃act 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文 Abs仃act Two—Component Systems are important for Mycobacterium tuberculosis to survive in the extreme environment in rmcrophage，such as hypoxia,nilric oxide and nutritional deficiency．Little is known about the function and its stream signal of Rv08 l 8一一tl℃ orphan response regulator involved in Mycobacterium tuberculosis Two—coraponcnt systems．We constructed Rv08 1 8 dektion strain by specialized Iransduction．The purpose of this stud