结核分枝杆菌CFP10基因密码子优化DNA疫苗的构建及免疫效应的评价-病原生物学专业论文.docxVIP

1 1 结核分枝杆菌 CFP10 基因密码子优化 DNA 疫苗的 构建及免疫效应评价 中文摘要 目的：（1）构建包含密码子优化 CFP10 基因的结核 DNA 疫苗 pVAX1/CFP10-o。 （2）初步评价该疫苗免疫小鼠所诱导的免疫效应。 方法：（1）根据小鼠和人的密码子使用偏好，使用 Gene Optimizer 软件对结核分 枝杆菌 CFP10 蛋白的编码基因进行优化，但不改变其氨基酸的序列。优化后的 CFP10 基因序列由南京金斯瑞公司进行全基因合成并插入真核表达载体 pVAX1，构建包含 密码子优化 CFP10 基因的真核表达质粒 pVAX1/CFP10-o。同时，从结核分枝杆菌 H37Ra 株基因组中，PCR 扩增天然密码子 CFP10 基因，经 EcoRⅠ和 HindⅢ双酶切 后，纯化后的酶切产物 CFP10 基因与经同样酶切处理的真核表达载体 pVAX1 连接， 构建包含天然密码子 CFP10 基因的重组质粒 pVAX1/CFP10，用酶切及测序的方法鉴 定 pVAX1/CFP10-o 和 pVAX1/CFP10 重组质粒构建是否正确。（2）以 EcoRⅠ和 Hind Ⅲ将质粒 pVAX1/CFP10 进行双酶切获得 CFP10 基因，亚克隆至原核表达载体 pET42a(+)中，构建原核表达质粒 pET42a/CFP10，转化大肠杆菌 BL21，在 IPTG 诱 导下表达重组蛋白 CFP10，获得的蛋白经 His 亲和层析柱纯化，并采用 SDS电泳和 western blot 对表达产物进行分析和鉴定。纯化后的蛋白再通过去细菌去 内毒素试剂盒进一步纯化去除内毒素，并以鲎试验检测内毒素去除效果。（3）大 量提取经鉴定正确的包含密码子优化 CFP10 基因的真核表达质粒 pVAX1/CFP10-o 及包含天然密码子 CFP10 基因的 pVAX1/CFP10 重组质粒，经梭华-SofastTM 介导体 外转染 Hela 细胞，并通过 RT-PCR、间接免疫荧光法检测重组质粒是否能在真核细 胞内表达；将 pVAX1/CFP10-o 和 pVAX1/CFP10 重组质粒以肌肉注射辅以体内电穿 孔的方式体内瞬时转染小鼠骨骼肌，免疫组织化学法检测其在骨骼肌细胞内的表 达情况。（4）将 28 只 SPF 级 BALB/c 小鼠分为 4 组，即 pVAX1/CFP10-o 组，pVAX1/CFP10 组，pVAX1 空质粒组，NS（生理盐水）组，分别以 pVAX1/CFP10-o、pVAX1/CFP10、 pVAX1 质粒和 NS 经肌肉注射辅以体内电穿孔途径进行免疫，每 2 w 加强免疫一次， 共免疫 3 次。间接 ELISA 法检测初次免疫后 0、2、4、6 w 小鼠血清中 CFP10 特异 性抗体 IgG 的水平；ELISA 法检测末次免疫后 2 w（第 6 w）小鼠血清中 IFN-γ 的 PAGE PAGE 2 浓度；ELISPOT 法检测末次免疫后 2 w（第 6 w）小鼠脾淋巴细胞和重组蛋白 CFP10 共培养后产生 IFN-γ 的 T 淋巴细胞数量；流式细胞仪检测 CFSE 标记的末次免疫后 2 w（第 6 w）小鼠 T 淋巴细胞经重组蛋白 CFP10 刺激后的增殖动力学变化，用 flowjo 软件分析其增殖指数。 结果：（1）构建的 pVAX1/CFP10-o 和 pVAX1/CFP10 重组质粒，经酶切电泳鉴定均 分别于约 3000 bp 和 300 bp 处各见 1 条带；测序结果显示插入基因序列均分别与 设计的 CFP10 优化基因和结核分枝杆菌 H37Rv 株 CFP10 编码基因序列一致。（2） 成功构建 pET42a/CFP10 质粒,经酶切电泳鉴定分别于约 5900 bp 和 300 bp 处各见 1 条带；测序结果显示插入基因序列与结核杆菌 H37Rv 株 CFP10 编码基因序列一致。 转化有重组质粒的 BL21（DE3）经过 0.1 mmol/L IPTG、37℃诱导 6 h，高效表达 了占菌体蛋白总量 40%的可溶性融合蛋白，经 His 亲和层析柱纯化后的相对分子量 约为 37 KD 的蛋白能与 CFP10 多克隆抗体发生特异性的结合反应，经 ToxinEraserTM 去内毒素试剂盒进行去除内毒素处理后，鲎试剂检测蛋白内毒素为阴性。（3）质 粒转染真核 Hela 细胞后经 RT-PCR 检测结果显示 pVAX1/CFP10-o 和 pVAX1/CFP10 质粒组均 得到预期的目的条带 ；间接免疫荧光 结果 显 示 pVAX1/CFP10-o 和 pVAX1/CFP10 质粒转染的 Hela 细胞均可见特异性绿色荧光，且 pVAX1/CFP10-o 组 荧光强度高于 pVAX1/