结核分枝杆菌MPT83重组腺病毒载体的构建及表达-遗传学专业论文.docxVIP

Ⅷ111I| Ⅷ111I| |11fl Ⅲ舢0|llI|《fllIIIl Y1 8 1 3 1 0 1 目 录 摘要 ： ．．I ABSTRACT III 第1章文献综述 l 1．1结核病的发病机理 l 1．2机体抗结核分枝杆菌感染的机制 l 1．3结核病疫苗 4 1．4腺病毒载体构建综述 8 第2章引言 1 0 2．1研究的背景 l 0 2．2研究的目的与意义 l 0 第3章材料与方法 l 2 3．1材料、试剂、实验仪器 l 2 3．2方法 l 5 第4章结果与分析 28 4．1结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA的提取与定量 28 4．2重组穿梭质粒的构建与鉴定 28 4．3重组腺病毒的构建及其鉴定 29 4．4重组腺病毒质粒转染HEK293细胞 3 l 4．5病毒扩增和滴度测定 3 1 4．6 mRNA水平上检测目的基因表达 3 l 4．7蛋白水平上检测目的基因表达 33 4．8体外淋巴细胞增殖 33 4．9活体荧光成像 3 5 第5章讨论 36 第6章结论与展望 38 6．1结j沦 3 8 6．2展望 3 8 参考文献 39 附录 4 5 致谢 46 发表论文及参加课题 47 两南人’7-硕十学何论文 两南人’7-硕十学何论文 摘璎 结核分枝杆菌MPT83重组腺病毒载体 的构建及表达 遗传学硕士研究生： 陈水木 指导教师： 邓洪平副教授何秀云副研究员 摘 要 结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTa)感染引起 的慢性传染病，MTB可能侵入人体全身各种器官，但主要侵犯肺，称为肺结核。据世界卫生 组织(wHo)统计，全世界每年有1000万新发病例，150万人死于结核病。我国高居全球结核 病高负担国家的第二位，现有MTB感染人数已达4亿，传染性TB患者达到200万。卡介苗(BCG) 作为目前唯一用于预防结核病的疫苗，对于儿童重症结核病如粟粒型结核和结核性脑膜炎具 有预防作用，但是对于预防成年人结核病效果不理想，保护率为0-80％不等。目前，很多国家 都在研究结核新疫苗，已有200多种的候选疫苗，其中有的正在进行动物模型实验，有的已经 进入临床实验。近几十年，随着耐药MTB增多及HIV共感染等问题，加重了结核病的严重性。 所以开发新型有效的结核病疫苗迫在眉睫，希望尽快开发出更安全、高效、低成本、并可广 泛用于各类人群的新型结核病疫苗。 本文以广泛使Hj的Ad-Easy腺病毒包装系统为基础，构建结核分枝杆菌MPT83重组腺病毒 疫苗。首先PCR获取结核分枝杆菌MPrr83基因，然后再将MPT83基因重组于穿梭载体 pAdTrack-CMV通过化学转化法将线性化的重组穿梭质粒(pAdTrack-CMV．MPT83)和病毒 骨架质粒(pAdEasy-1)共转入大肠杆菌BJ5183，重组穿梭质粒和病毒骨架质粒在BJ5183发生同 源重组形成重组腺病毒质粒(rAd．GFP-MPT83)；线性化的重组腺病毒质粒转染HEK293细胞， 并于HEK293细胞中包装成病毒；mRNA和蛋白水平上检测目的基冈的表达：人量扩增腺病毒， 体外通过MTT实验初步验证重组腺病毒的免疫原性：体内通过重组腺病毒免疫小鼠，整体荧 光成像观察报告基冈绿色荧光蛋白(GFP)在小鼠体内的表达与分布，间接跟踪目的基冈在小 鼠体内的表达情况。结果表明： 两南人学硕十学佛论文 两南人学硕十学佛论文 摘要 (1)成功构建结核分枝杆菌MPT83重组腺病毒载体，构建的重组腺病毒载体于HE愆93细胞 中成功包装腺病毒。通过RT-PCR和、№stem—Blotting实验，分别TmRNAjflI蛋白水平上 检测均表明结核分枝杆菌MPT83基因在HEK293细胞中表达。 (2)MTT实验表明：vAd．GFP．MPT83病毒液比vAd．GFP病毒液具有更强的刺激体外淋巴细 胞增殖的能力，证实了目的蛋白具有很强的刺激淋巴细胞增殖的能力，即其免疫原性。 (3)小鼠活体实验表明：vAd．GFP．MPT83病毒免疫小鼠后，报告基因GFP于免疫后第4d 达到高峰，一直到半个月之后还有很强的表达，同时表达的范围也由原来注射的部位 向周边扩散。 关键词：结核分枝杆菌MPT83重组腺病毒载体重组腺病毒 两南人学硕十学何论文 两南人学硕十学何论文 Abstract Studies on the Construction and Expression of Recombinant Adnovirial Vector Encoding th e MPT83 Gen e of Mycobacterium tuberculosis Major：Genetics Speciality：Cellular and Mole