结核分枝杆菌RmlB的表达、纯化及酶促反应动力学研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

学位论文版权使用授权书本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留、使 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留、使 用学位论文的规定，同意大连医科大学保留并向国家有关部门或机构 送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权 大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论 文。 指导教师签名： 鼙缸羔 论文作者签名： 签字日期： ≥盟年【月Ⅱ日 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：．玉迄丑奄． 签字Et期： 垃年上月韭日 结核分枝杆菌RmlB的表达、纯化 结核分枝杆菌RmlB的表达、纯化 及酶促反应动力学研究 硕士研究生： 张月新 指导教师： 马郁芳教授 指导小组： 辛毅教授 专业名称： 生物化学与分子生物学 摘 要 由结核分枝杆菌引起的结核病是严重危害人类健康的传染病，主要 的原因是耐多药的结核分枝杆菌菌株的增加，而现有的抗结核药物不能 有效的治愈结核病，所以每年有900万的新增病例，300万人死亡．研 究新一代的抗结核药物迫在眉睫。 细胞壁是分枝杆菌赖以生存的结构基础，所以结核分枝杆菌的细胞 壁可以作为新药研发的靶标。其核心结构由肽聚糖，聚阿拉伯糖半乳糖 和分枝菌酸组成，其中分枝菌酸和聚阿拉伯糖半乳糖通过衔接双糖L·鼠 李糖．D．N．乙酰葡糖胺共价连接到肽聚糖分子上，如果破坏了衔接双糖的 结构，就会破坏结核分枝杆菌的细胞壁，导致细胞的死亡。由于人体中 不存在鼠李糖分子，因此鼠李糖可以作为研发新一代抗结核药物的重要 靶点。结核分枝杆菌基因组中rm以．D四种基因编码了RmlA-D四种 酶，参与了由底物1．磷酸葡萄糖合成dTDP．L．鼠李糖的过程。所以 RmlA．D四种酶的任一种酶都可作为开发抗结核新药的靶标。 结核分枝杆菌RmlB即dTDP．D．葡萄糖．4，6．脱氢酶是dTDP-L· 鼠李糖合成过程中第二步反应所需的酶。为了深入研究RmlB的活性， 我们首先要克隆编码这种酶的rmlB基因，然后利用大肠杆菌高效表达 RmlB蛋白质，为进一步研究RmlB酶的酶促反应动力学及建立筛选抗 结核药物的酶反应体系提供物质保障。 本论文的目的是：(1)用PCR法从结核分枝杆菌基因组DNA中扩 增Tb rmlB基因：(2)将Tb rmlB基因克隆到pMDl 8．T的克隆载体 中，并对DNA序列进行测定；(3)将Tb rmlB基因亚克隆到pET29b 表达载体中并通过改变不同的诱导条件在大肠杆菌BL21(DE3)中表达 RmlB蛋白质；(4)用亲和层析法纯化重组RmlB蛋白质，并用Western Blotting方法鉴定RmlB蛋白质；(5)建立测定RmlB酶的活性；(6)确 定RmlB酶的最佳反应条件并测定RmlB酶的反应动力学常数。 定RmlB酶的最佳反应条件并测定RmlB酶的反应动力学常数。 本论文所获得的结果如下： 1．用PCR方法对目的基因Tb rmlB的扩增 从结核分枝杆菌H3 7R菌株基因组数据库(http：／／genoIist．pasteur．f -r．／TubereuList／)中获得Tb rmlB基因的核苷酸序列(996 bp)。根据其 核苷酸序列设计一对PCR引物，并在上游引物和下游引物的5’端分别 引入Nde I和Xho I限制性内切酶位点。以便将Tb rmlB基因克隆到 pET29b表达载体的Nde I和Xho I位点。用具高保真的primer STARⅢHS聚合酶，以H3 7Rv菌株基因组DNA为模板成功扩增了Tb rmlB基因。 2．pMDl 8一Tb rmlB的构建及核苷酸序列测定 将纯化的PCR产物与pMDl 8．T载体进行连接，然后将连接产物 转化入大肠杆菌NovaBlue菌株的感受态细胞中。用限制性内切酶酶切 的方法鉴定阳性重组质粒。对pMDl 8．Tb rmlB中的Tb rmlB基因进行 DNA序列测定，对DNA测序结果进行BLAST分析，将所测得的核苷 酸序列与Tb rmlB基因进行序列比对，发现在798 bp处由G变为T， 但氨基酸序列未发生任何改变，表明在本实验中利用PCR方法获得的 Tb rmlB为正确的基因，理论上能够正确表达出Tb RmlB蛋白。 3．表达载体pET29b．Tb