结核分枝杆菌多聚磷酸盐外切酶Rv1026对耻垢分枝杆菌的菌落形态和生物膜的影响-微生物与生化药学专业论文.docxVIP

目 目 录 摘要 ABSTRACT 第一章综述 。 l 1．1多聚磷酸盐在微生物中的作用的研究进展 1 1．2 POLYP代谢酶的研究进展 。3 1．3应用研究进展 9 第二章前言 第三章实验材料和方法 3．1实验材料和试剂 。12 3．2实验方法 1 3 第四章结果与讨论 。 19 4．1 Rvl026基因的PCR扩增和鉴定 19 4．2耻垢分支杆菌杆菌的转化和阳性克隆的筛选 。20 4．3重组耻垢分枝杆菌电穿孔后长出来的菌落 20 4．4重组耻垢分枝杆菌抗性 。2l 4．5重组菌细胞内的多聚磷酸盐水平及生长动力学 ．．21 4．6重组菌的菌落形态及其滑动能力的改变 。22 4．7重组菌在生物膜形成能力上的改变 24 4．8重组菌细胞表面脂肪酸组成的改变 25 第五章结论与展望 ．27 参考文献 29 致谢 ．31 发表论文及参加课题一览表 ． ．32 两南大学硕十毕业论文 两南大学硕十毕业论文 摘要 结核分枝杆菌外切多聚磷酸酶Rvl026对耻 垢分枝杆菌菌落形态和生物膜的影响 微生物与生化药学专业硕士研究生：石廷玉 指导老师：谢建平研究员 摘 要 结核病是一种严重危害人类健康的传染病。全球近1／3的人口感染结核菌。随 着人类社会和药物治疗的发展，人们对结核病的致病菌一一结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis)的生物学特性有了进一步的研究，继而研发了链霉 素、异烟肼、利福平等治疗性药物，使得人类对结核病的控制取得了可喜的成绩， 遏制了结核病的蔓延和传播。然而由于化学药物的不合理应用、艾滋病与结核病 联合感染、人口流动的增加以及耐药结核病菌的流行，使得近年来结核病疫情下 降缓慢，在部分地区甚至有所回升。当前，在结核病控制工作中急需有效的预防 性、治疗性疫苗和新型药物。寻找新的药物作用靶点和开发新型抗结核药物已成 为当前最为关注的焦点。 多聚磷酸盐(polyP)是由几个到几百个无机磷酸盐单体通过高能磷酸键聚合 而成的线性多聚体，广泛分布于自然界和生物体。polyP在生物体中起到重要功能， 包括基因表达和调控、DNA的摄取、微生物的运动性、对胁迫和饥饿的应答、病 原菌的毒性、以及对乳腺癌细胞的增殖、血液凝固、细胞钙化、线粒体功能的调 节等。细胞内参与polyP代谢的酶包括内切酶、外切酶、葡萄糖激酶、NAD激酶和 AMP磷酸转移酶等。细胞内合成和分解polyP的两个主要酶分别是多聚磷酸盐激酶 (polyphosphate l(iI娜e，PPK)和外切聚磷酸酶(exopolyphosphatase，PPX)。结 核分枝杆菌中的PPK已经得到一定程度的研究。结核分枝杆菌I均ppkl基因的表达下 调与药物诱导的转录抑制相关，表明多聚磷酸盐代谢与抑制转录过程的联系。 Kamakshi Sureka等报道_ppkl涉及结核分枝杆菌在低氧，变性剂压力和氧化压力条 件下的存活。其作用机制为：而MprB优先利用多聚磷酸盐将MprA磷酸化，从而促 J,拄．sigE的转录，产生的SigE调节严紧应答调节子陀，的转录。Ppkl的表达下降导致结 核菌在巨噬细胞中存活能力的下降，表n)jppkl在细菌的细胞内生活起到重要的功 能。此外，另一个多聚磷酸盐激酶PPK2能利用多聚磷酸盐将GDP转化为GTP，维 持GTP的平衡。核苷酸库的平衡对许多生理过程非常重要，例如，结核分枝杆菌一 个重要的细胞壁组份——脂阿拉伯甘露聚糖就是从1．磷酸甘露糖和GTP合成。实验 西南大学硕士毕业论文 西南大学硕士毕业论文 摘要 实)pk2的表达下调损伤其在巨噬细胞中的生存能力，意味着ppke在分枝杆菌定居 于巨噬细胞起到重要的生理功能。 然而，作为参与polyp代谢的另一个酶PPX目前的研究还很少，其在分枝杆菌 中的生理功能还有待进一步揭示。因此，开展对该蛋白的功能和性质的研究，有 助于进一步对结核分枝杆菌胞内的存活和免疫逃逸机制的研究。 系统进化分析表明结核分枝杆菌中的Rv0496和Rvl026可能具有外切多聚磷酸 酶活性。利用PSIPI汪D服务器的GenTHREADER程序搜寻，发现风产叶菌的 PPX／GPPA蛋白与结核分枝杆菌的Rvl026和Rv0496具有最高的结构相似性。基于风 产叶菌的PPX／GPPA的二级结构，我们用已研究的PPX序列与结核分枝杆菌中的同 源蛋白进行序列对比。发现结核分枝杆菌外切多聚磷酸酶具有与风产叶菌PPX的活 性位点Glul21和Ar993相对应的残基Glu和Arg，结核分枝杆菌PPX存在焦磷酸结合 位点Asp22，Ar9267，Glul44和Glu21 1对应的残基，还具有富含甘氨酸的磷酸盐结 合环(P．100p Glyl43．Serl46)。目前关于尺vD496和RvJ『D26基因的研究主要来