结核分枝杆菌分泌性酸性磷酸酶(SapM)对小鼠巨噬细胞自噬的抑制作用-免疫学专业论文.docxVIP

摘 摘 要 摘 要 目的：建立可以稳定表达红色荧光蛋白。绿色荧光蛋白．微管相关蛋白轻链3 (RFP．GFP．LC3)的小鼠巨噬细胞RAW264．7细胞系，为自噬研究提供材料。 研究结核分枝杆菌分泌性酸性磷酸酶(SapM)对小鼠巨噬细胞自噬的影响，探究 Rab7在结核杆菌毒力因子SapM诱导的自噬体．溶酶体融合阻断中的作用。 方法： 1．用分子克隆的方法构建含RFP．GFP．LC3基因的慢病毒重组质粒载体，将重组质 粒与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞，收集病毒液上清后感染RAW264．7 细胞。经嘌呤霉素筛选获得稳定表达RFP．GFP．LC3的RAW264．7细胞株，分别 用荧光显微镜和流式细胞仪分析感染效率。饥饿处理稳定感染的细胞，荧光显微 镜下观察细胞内的RFP．GFP．LC3斑点。 2．分别用SapM、渥曼青霉素、饥饿处理GFP．LC3．RAW264．7细胞。荧光显微镜 下观察自噬体的形成，Western blot法检测微管相关性蛋白轻链3(LC3)II水平； 再用SapM处理GFP．LC3．RAW264．7细胞后加氯喹，Western blot法检测LC3II 水平。 3．siRab7转染RAW264．7细胞，用蛋白免疫印记检测P62。mCherry．SapM转染 RAW264．7后免疫组化分析SapM与Rab7共定位情况，免疫共沉淀分析SapM与 Rab7的关系。用三种SapM的突变体SapM△姒，SapM△F趾D和SapM△cT转染 RAW264．7细胞，分析SapM的不同突变体与Rab7的关系。 结果： 1．成功构建了慢病毒载体pLV-CMV-RFP．GFP．LC3，经感染和嘌呤霉素筛选获得 了稳定表达RFP．GFP．LC3的RFP—GFP．LC3-RAW264．7细胞； 2．SapM和饥饿均导致GFP。LC3斑点增多和LC3II水平增高，在SapM处理的细 胞中加入氯喹并没有引起LC3II的进一步升高。 3．siRab7处理后，细胞P62水平显著增高；免疫组化显示SapM与Rab7在胞内 共定位：免疫共沉淀分析显示SapM与Rab7可相互沉淀；三种不同突变形式的 SapM中，只有SapM△cT不能与Rab7相互作用。 结论：稳定表达RFP．GFP．LC3的RAW264．7细胞株成功建立，为自噬的研究建立 了细胞平台。SapM可阻断自噬体与溶酶体的融合，从而抑制小鼠巨噬细胞自噬。 SapM诱导的自噬体．溶酶体融合阻断依赖于SapM与Rab7的相互作用。 万方数据 摘 摘 要 图【10】表【0】参【41】 关键词：稳定表达；RhW264．7细胞：结核分枝杆菌分泌性酸性磷酸酶(SapM)；自 噬：Rab7：融合 分类号：(R392．12) Abstract Objective：To establish mice macrophage RAW264．7 cell strain with stable expression of red fluorescent protein--green fluorescent protein--microtubule associated protein light chain 3(RFP—GFP—LC3)reporter protein，which provide materials for studying autophagy．To investigate the effects of the virulence factor secretory acid phosphatase of Mycobacterium tuberculosis(SapM)on the autophagy of murine macrophages．To study the role of Rab7 in the blockage of autophagosome—lysosome fusion induced by SapM，a virulence factor of mycobacterium tuberculosis． Methods： 1．A lentiviral vector containing RFP—GFP-LC3 gene was constructed by general molecule clone methods．Then the constructed plasmind and the packaging plasmids were packaged in HEK293T cells．The viral supernatant was collected and transfered into RAW264．7 cells．T