结核分支杆菌耐喹诺酮类药物的分子机制及其耐药基因检测方法的研究-呼吸专业论文.docxVIP

军医进修学院硕士研究生论文介苗相同，34株(75．6％)gyrA基因的sscP图谱与两者 军医进修学院硕士研究生论文 介苗相同，34株(75．6％)gyrA基因的sscP图谱与两者 均不相同。经对产物进一步测序(DNA．sequencing，Ds) 分析显示，5株喹诺酮敏感株及45株耐药株中，与卡介苗 gyrA基因sscP图谱相同者，其gyrA基因扩增片段碱基 序列与卡介苗相同，95位密码子为Acc；与H，。Rv ssCP 图谱相同的菌株，其扩增片段的碱基序列也与之相同，95 位密码子为AGc；45株喹诺酮耐药分离株中，10株90位 密码子有碱基突变，24株94位密码子有碱基突变，与 PcR，SSCP方法检测结果完全一致。 对45株喹诺酮耐药分离株进行氧氟沙星和左旋氧氟 沙星药物浓度梯度测定，进一步研究了氧氟沙星和左旋氧 氟沙星耐药程度与gyrA基因突变的关系。发现所有存在 gyrA基因突变的分离株，氧氟沙星4ug／ml≤MIcs≤32 ug／lnl，左旋氧氟沙星2ug／ml≤MIcs≤16 ug／ml；氧氟沙 星MIcs≥4ug／ml，左旋氧氟沙星MIcs≥2ug／ml的临床分 离株gyrA基因突变率均为100％。 电压、凝胶交联度和浓度等因素均会影响sscP的分 析。本文对PcR．sscP方法的实验条件进行了探索，发现 对gyrA基因285 bp片段扩增产物采用8％(29：1)非变性 聚丙烯酰胺凝胶在120v稳压下泳动6小时效果较理想。 gyrA基因突变，尤其90位和94位密码子突变是结核 分支杆菌耐喹诺酮类药物的主要分子学机制。PcR．sscP 可快速检测出部分结核分支杆菌喹诺酮耐药株，与DNA 测序结果的符合率为loo％，但较DNA测序法简便、快捷， 便于临床推广应用。PcR．sscP有可能成为测定结核分支 军医进修学院硕士研 军医进修学院硕士研 究 生论文 杆茵对 喳诺画同耐药的快速 方法，并 有望直接用于临床标本 的检测。 关键词:结核分支杆菌，喳诺阔， gyrA 基因，药物敏 感性，聚合酶链反应，单链构象多态性， DNA 测序 、 - 3 军医进修学院硕士研究生论文Studies 军医进修学院硕士研究生论文 Studies of Molecular Mechanisms of Quinolones Resistance and Detection Methods of Gene Mutation in Mycobacterium Tuberculosis Abstract In order to study molecular mechanisms of quinolones resistance and detection methods of gene mutation in^矿 f“6Prc“，DsiJ， 30 quinolones—sensitive isolates and 47 quinolones—resistant isolates were s沁died． Firstly， theh species were identined with l 6S 1’RNA gene by polymerase chain reaction—single—stranded confbrmation polymorphi— sm(PCR—SSCP )．Among them，75 lsolates had the same 1 6S rR。NA SSCP pronles as that of the standard strain of。mf ，甜69，c“，Dsfs， the other 2 quinolones—resistant isoIates were non—tuberculous Mycobacteria． Products of gyrA—PCR amp“fication were 285 bp f●agment． The sensitivity of the primers was 1pg． 19 ⅣIycobacte ria strains and 5 non—mycobacteria strains were amplified with gyrA primers respectiVely，the formers had positiVe products and the latters had nothing． The standard strain of A4 f“6P，c“，Dsfs and BCG were used as the contrDl groups，75 isojates of^Z f6Prc“fosfJ were analyzed by PCR—SSCP．