结核病血清学诊断试剂盒的分析-病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 10 缩略词表 英文缩写 英文全称 中方名称 BSA Bovine Serum Albumin 牛血清白蛋白 DIGFA dot immunofiltration assay 斑点免疫渗滤试验 EDTA Ethlenediamine tetra acetic acid 乙二胺四乙酸 ELISA enzyme-linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附试验 His Histidine 组氨酸 HIV Human Immunodeficiency Virus 艾滋病病毒 HRP horseradish peroxides 辣根过氧化物酶 IgG immunoglobulin G 免疫球蛋白 G IPTG isopropyl-β-thiogalactopyranoside 异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 kDa kilodalton 千道尔顿 LAM lipoarabinomannan 脂阿拉伯甘露糖 LPS Lipopolysaccharide 脂多糖 MTB Mycobacterium tuberculosis 结核分枝杆菌 OD Optical density 光密度 OPD o-phenylenediamine 邻苯二胺 PAGE Polyacrylamide gel eletrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PBS Phosphate-buffered saline 磷酸盐缓冲液 ROC receiver operating characteristic 受试者操作特征曲线 SD standard deviation 标准差 SDS Sodium dodecyl sulfate 十二烷基硫酸钠 SPA Staphylococcal Protein A 金黄色葡萄球菌 A 蛋白 TB Tuberculosis 结核 TEMED N,N,N,N-tetramethylethylenediamine N,N ,N’,N’-四甲基乙二胺 摘 要 目的：提取纯化结核分枝杆菌（MTB）特异性抗原，建立规范的MTB特异性抗 体酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)及斑点免疫渗 滤试验(dot immunofiltration assay, DIGFA)检测系统。用建立的检测系统检测血清 中的抗结核抗体，评价其在结核病（TB）血清学检测中的应用价值。 方法：以实验室现有的重组MTB蛋白库为基础，表达纯化11种具用应用前景的 MTB重组蛋白并提纯1种天然MTB脂多糖抗原（MTB-LPS）；分别确定各抗原最 佳包被浓度和最佳第二抗体稀释度，建立规范的ELISA检测系统，用建立的 ELISA检测系统检测192例结核血清，68例非TB患者血清，210例健康人血清共 470份血清标本中的抗结核抗体水平，并比较在不同的阳性界值下各种抗原对TB 检测的灵敏度及特异度的差别，以此筛选出敏感性好、特异度高、互补性强的抗 原进行组合，并评价该组合在TB血清学诊断中的价值。以该抗原组合为基础建 立胶体金免疫渗滤检测系统并对检测120例结核血清，60例非TB患者血清，60例 健康人血清共240例血清标本进行检测，同时以目前已获得临床批文、国内应用 广泛的MTB抗体胶体金法诊断试剂盒（上海奥普生物医药有限公司生产）作为 参比试剂进行对比试验，评价该免疫胶体金渗滤试剂盒在TB诊断中的应用价值。 结果： 1、 经亲和层析后得到了11种纯度较高的MTB重组蛋白，提纯的MTB脂多糖抗原 未见核酸及蛋白残留。 2、 获得优化的ELISA检测条件：辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗人IgG最佳 稀释度为1:10000，重组蛋白最佳包被浓度在1.6-6.3 ug/ml之间，脂多糖抗原 最佳包被浓度为0.16ug/ml。并应用ELSA检测系统检测了470例血清标本中抗 结核抗体水平，以ROC曲线计算出最佳临界点作为界值，12种抗原的灵敏度分 别为60.5%至82.9%，特异度分别为64.1%至92.7%；以?x±3SD作为界值，12种 抗原的灵敏度分别为13.3%至40.5%，特异度分别为96.4%至99.5%。 3、 各抗原之间存在一定的相关性和互补性，不能互相替代；将具有较强互补作 用的r38kD、MTB-LPS、r16kD、rMPT63四种抗原进行组合过程中，随着组 合抗原数的增多，检测灵敏度由29.0%提高至65.2%，特异度仅由96.9%降至 90.0%。 4、 制备了以r38kD、MTB-LPS、r16kD、rMPT63四种抗原为基础的免疫胶体金 渗滤试剂盒。240例血清标本的检测结果显示，本文制备的免疫胶体金渗滤试 剂盒与MTB抗体胶体金法诊断试剂