结核分支杆菌katG基因突变与其耐异烟肼机制的系列分析-传染病学专业论文.docxVIP

中文摘要 ／异烟肼(INH)作为抗结核治疗的首选药物，对结核病的有效 控制发挥了重要作用。但近年来结核分支杆菌对INH耐药性以及多 重耐药的出现已成为抗结核治疗中的重大障碍。研究结核杆菌对INH 的耐药机制并创建一种对临床分离茵进行快速检测的有效手段，是 目前迫切需解决的问题。katG基因的变异(包括点突变、缺失、 插入等)可以解释9 O％以上的INH耐药。因此研究异烟肼耐药机制 离不开对kat G基因的检测与分析．在目前异烟肼耐药机制研究中 遇到的问题有二，一是如何有效、低成本筛选异烟肼耐药基因，二 是如何对筛选出的突变体进行评估．特别是后者，目前是公认的难 点，这也是临床应用分子生物学技术检测耐药菌株的限制因素．、j 本课题在国内首次利用基因重组技术克隆成功结核杆菌katG 基因，实现了重组katG蛋白的高效表达与纯化，并在此基础上建 立了检测katG蛋白功能的方法，为从基因功能上研究耐药机制打 下籼出． ／， f7在成功katG基因克隆并完成katG基因的表达及其表达产物 的纯化后，本研究在国内首次应用定点诱变技术获得临床中最为常 见的katG突变体(S3l 5T与1t46 3LkatG)，比较突变体蛋白与野生 型蛋白功能的差异，以此评价临床耐药菌常见突变位点的意义。在 国内首次从机制上对突变体的意义进行了评估，而不是仅仅停留在 分子流行病学的分析上，为进一步以分子生物学技术检测临床异烟 肼耐药奠定基础。 最后，本研究从PCR-SSCP技术着手，对临床耐异烟肼菌株进 行了筛检，此后结合电转化技术将野生型katG基因与突变体基因 转化进入高度耐异烟肼、katG基因缺陷的耻垢分支杆菌(M． Smegmati S)，比较转化后M．Smegmati S对异烟肼药敏的变化，从 而判断突变体在耐药机制中的意义。最后，提出了在以上研究的基 础上如何制定筛选临床耐药菌株以及评估耐药相关性突变体的策 略．1 。) 。) ，／ ，／ ／ 第一廓》、结核分支杆菌KatG基因的克隆及功能的初步分析， 本研究用PCR方法克隆katG基因并将其构建在表达载体pET24b 上，利用大肠杆菌偏爱的T7噬菌体启动子，在IPTG诱导下高效表 达katG蛋白。(所表达的蛋白为N末端携带6个组氨酸的融合蛋白， 有利于进一步采用镍亲和柱一步纯化来获得高纯度的表达产物。通 过基因重组获得的KatG表达载体转化到大肠杆菌后高效表达了 katG蛋白，相对分子质量约为80 x 1 03，表达量可占总茵体蛋白的 17．7％。表明该基因重组的菌株为katG的高表达菌株，进一步对表 达产物进行纯化后可提取到纯度超过90％的katG蛋白。对表达产 物进行初步过氧化氢酶活性研究验证了其酶活性。哆本研究为进一步 研究katG蛋白奠定了知出。 二、定向诱变法克隆katG基因突变体以及对其功能的比较分析， 本部分的研究成功地以定点诱变的技术克隆了ka tG基因的 两个常见突变体(R46 3L与s 31 5T)，并以直接测序对诱变结果作了初 步验证／应用本文第一部分建立的方法，对突变体的katG进行克隆 与表达，检测突变体katG蛋白与野生型蛋白在功能上的区别，从而 直接对该两个突变点在耐药机制中的意义作出论证，希望能为今后 以分子生物学方法检测耐药株作出一些基础性的铺垫．通过对突变体 的过氧化氢酶的活性检测发现，s31 5T位的突变导致过氧化氢酶活 性较野生株显著下降(约降低5 0％左右)，提示该密码子突变与katG 功能改变造成过氧化氢酶活性降低密切相关。R46 3L突变体的情况 有所不同，该位点的突变并未带来katG的过氧化氢酶活性降低。结 合目前临床菌株中不断发现有该位点的突变，可以得出初步结论， 即将463密码子突变作为检测耐药的依据尚不充足．j 三、katG突变体的检测与评价 本部分研究从对INH耐药最为重要的katG基因着手，建立最有 效、低成本的突变点初筛方法一一PCR～SSCP(Single st rand Conformation Polymorphi sm，多聚酶链反应一单链构象多态)分析 法，进而结合本研究的第一与第二部分工作(即KatG基因的克隆技 术、定点诱变技术)以及KatG基因转导提出评价突变点意义的策略． (PCR—SSCP是一种DNA单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象 的等长DNA单链中中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁徙率变化来检测 基因变异，该法具有快速、AI司rAb便、灵敏和适于大样本筛查的特点， 可有效检出碱基置换、缺失、插入等基因，本研究以katG包含31 5 、≯‘ 3 位点的约260bp的片段为例，建立katG基因点突变的初筛方法．本 位点的约260bp的片段为例，建立katG基因点突变的初筛方法．本 研究进一步通过电