结核分枝杆菌螺旋酶GyrB与GyrA相互作用核心区域的研究-预防兽医学专业论文.docxVIP

本研究由艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治科技重 本研究由艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治科技重 大专项(项目编号2008ZXl 030 1)和国家自然科学基金 (3 1 070685)资助 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 不 如需保密，解密时间 年 月 日 是否保密 D 独创性声明 本人声明所里交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果．尽我所知，除了文中特另lj加以标注和致谢酌地方外。论文中不包含其他入已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 面使用过的枋耩，指导教缔砖她进行了审定．与我一同工作的同志对本研究所做的任 侮贡献均巴在论文中做了明确的说明，并表示了谢意． 研究生签名： 主辛易 时闻： 劲f 1年 歹月7多日 签名日期：伽l{年岁月硝日：二签名日期：夕烈1年歹月—守。 注：请将本表逝接装订在学位论文的癣贾和弱录之闻 结核分枝杆菌螺旋酶GyrB与OyrA相互作用核心区域的研究目录 结核分枝杆菌螺旋酶GyrB与OyrA相互作用核心区域的研究 目录 摘要 ．I Abstract ． ll 缩语表 ．III l前言 l 1．1结核病现状 ．1 1．2 DNA拓扑异构酶分类 ．．1 1．3 Topoisomerasc II的研究现状 ．．2 1．4 DNA Topoisomerase II互作蛋白研究进展 ．．3 1．4．1与Topoisomcrasc II不同区域相互作用的蛋白 4 1．4．2在减数分裂过程中与Topoisomerase II相互作用的蛋白 6 1．4．3在细胞中定位不同的相互作用蛋白 6 1．5结核分枝杆菌Topoisomcrasc II结构与功能作用 9 1．5．1结核分枝杆菌Topoisomerase II功能作用 9 1．5．2 Toprim结构域的功能与作用 9 1．6蛋白质相互作用研究方法 ．．1 l 1．6．1酵母双杂交 11 1．6．2 pull down技术 ．12 1．6．3等离子共振技术 12 1．6．4免疫共沉淀 一： 1 3 1．6．5荧光共振能量转移 。13 1．6．6双分子荧光互补 ．．14 1．6．7蛋白质微阵列 l 5 2研究目的与意义 ．16 3材料与方法 17 华中农业大学201 华中农业大学201 l届硕士研究生学位论文 3．1材料 17 3．1．1培养基 。17 3．1．2各种分子生物学酶、常用试剂盒及常用试剂 ．．17 3．1．3溶液及缓冲液 ．1 8 3．1．4仪器 19 3．1．5质粒 20 3．1．6菌株 2l 3．2方法 2 1 3．2．1结核分枝杆菌螺旋酶GyrB}其系列缺失突变体的构建 ．2l 3．2．2结核分枝杆菌螺旋酶GyrB缺失突变体蛋白的表达与纯化 27 3．2．3酵母双杂交实验检测结核分枝杆菌螺旋酶GyrA、GyrB之间相互作用 30 3．2．4 SPR方法检测结核分枝杆菌螺旋酶GyrA、GyrB之间的相互作用 ．3l 3．2．5 GST pull down检测结核分枝杆菌螺旋酶GyrA、GyrB之间的相互作用．3l 4结果与分析 32 4．1结核分枝杆菌螺旋酶GyrB与GyrA相互作用区域的分析 32 4．2各缺失突变体的构建及蛋白质的表达纯化 ．： 33 4．2．1 GyrB突变体的pET28a和pGADT7载体的构建 ．．33 4．2．2 GyrB突变体蛋白质表达与纯化 37 4．2．3 pGEX．KG．gyrA载体构建及带GST-tag A亚基的表达纯化 ．．39 4．3酵母双杂交方法验证GyrA亚基与GyrB及其缺失突变体的相互作用 40 4．4 GST pull down技术验证G蝉与GyrB缺失突变体之间的相互作用 42 4．4．1 GST pull down检测GyrA与GyrB、GyrB／k548—564相互作用 43 4．4．2 GST pull down检测GyrA与GyrBl—518、GyrBl—531相互作用 ．．44 4．4．3 GST pull down检测GyrA与GyrB 1．550、GyrB／k53 1—550相互作用 ．．44 4．5表面等离子共振方法检测A亚基与缺失突变体之间的相互作用 45 4．5．1 GyrB结合活性趋势图及动力学常数 ．．45 结核分枝杆菌螺旋酶cb帕与(秒rA相互作用核心区域的研究4．5．2各缺失突变体结合活力与野生型比较趋势图 结核分枝杆菌螺旋酶cb帕与(秒rA相互作用核心区域的研究 4．5．2各缺失突变体结合活力与野生型比较趋势图 46 5讨论 ．48 5．1蛋白质二级结构在空间结构中的作用 ．．48 5．2 a螺旋531．5