结核杆菌蛋白芯片-ELISA诊断技术研究-预防兽医学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 1 中文摘要 结核病是由结核分枝杆菌引起的一种人畜共患的慢性消耗性传染病。据估计，全球 约有 20 亿的人口感染结核病，精准、及时高效地对结核病病人进行诊断是治疗和控制 结核病所必需的。结核菌素实验（PPD）是目前临床诊断牛结核病常规的方法，也是国 际动物卫生组织与我国规定的法定检疫手段。然而由于 PPD 抗原也许包含有与其它分枝 杆菌相同的抗原成份,检测时诊断结果假阳性高,而且此诊断方法不能区分自然感染和 卡介苗免疫。此外还有其他许多结核杆菌的诊断方法如痰涂、菌培、结核杆菌 DNA 扩增 法检测法等,但这些方法不但需要昂贵的仪器设备和专业的人员操作，而且具有检测时 间长、操作过程繁琐、诊断结果敏感性低等缺点,最终导致目前结核病临床检出率低， 说明以上检测方法不利于结核病的检测。为此，本实验研究了新型的结核病的快速诊断 方法： 采用多抗原多组分作为联合诊断抗原的方法，建立一种灵敏度好，高特异性的血清 学诊断方法。提取结核分枝杆菌 H37Rv 的基因组 DNA，采用分子克隆表达技术扩增 TB9.7、 38KD 、 MPB83 和 MPB70 基因片段，通过 pET-32a 构建质粒载体 pET-32a-TB9.7、 pET-32a-38KD、pET-32a-MPB83 和 pET-32a-MPB70，经测定序列正确后转化大肠杆菌 BL21(DE3),通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析重组蛋白的含量，同时用蛋白纯化试剂盒，完 成 ESAT-6、CFP10、ACR、Rv2626c、TB9.7、38KD、MPB83、MPB70 和 FadB4 的蛋白纯化， 并且进行 western blot 检测。将九种抗原分别进行 iELISA 条件的优化，制备可视化简 易蛋白芯片，建立“芯片”式 iELISA 诊断方法，并确定了 ELISA 诊断方法的判断标准， 即 S/P≥任一抗原阳性临界值为阳性,S/P所有抗原阴性临界值为阴性。ELISA 方法的特 异性为 97.5%，敏感性为 73.3%。对 30 份痰检阳性和 120 份健康人血清样品进行了检测, 并与痰检结果比较。30 份痰检阳性血清样品中有 22 份为 ELISA 检测阳性,阳性符合率为 73.3%,120 份健康人血清，3 份为阳性，其余为阴性，阴性符合率为 97.5%,本 ELISA 方 法与痰检诊断方法总符合率为 92.7%。试验结果表明,ELISA 方法具有较理想的开发和应 用前景。 关键词：结核杆菌，间接 ELISA，鉴别诊断 Abstract Tuberculosis that caused by Mycobacterium Tuberculosis is a chronic zoonosis. One-third of the world population is estimated to have Mycobacterium tuberculosis infection.Accurate and timely identication of infected individuals is critical for treatment and control . For the current detection of TB ，Purified Protein derivatives(PPD) is the only method recommended by OIE.Purified Protein derivatives(PPD) is a protein mixture that has complex components.PPD includes many antigens shared with other Mycobacterium species besides specific antigens of M.bovis.So,the PPD skin test cannot avoid the cross reaction with other mycobaeterial. Moreover the method propably provides false Positive results when there is serious tubereulosis or immunosuppressive conditions exist. Moreover,the current diagnostic methods such as smear、culture、PCR and so on lack the desired sens