结核分枝杆菌叶酸代谢相关基因Rv0992c的性质及功能研究-微生物与生化药学专业论文.docxVIP

目 目 录 摘里喜 一I ▲ Abstract III 船* 第一章综述 ．1 声 1．1叶酸代谢及MTHFS概述 ．．1 1．2结核分枝杆菌叶酸代谢研究进展 ．．4 第二章前言 6 第三章实验材料和方法 7 3．1材料和试剂 7 3．2试验方法 ．．1 O 第四章结果与讨论 17 4．1结核分枝杆菌H37Rv基因Rv0992c基因产物的理化性质 17 4．2结核分枝杆菌H37Rv Rv0992c基因编码蛋白的二级结构分析 一17 4．3不同物种间Rv0992c同源基因保守性的分析 一17 4．4结核分枝杆菌H37Rv Rv0992c编码蛋白的三级结构 。1 8 4．5 MTHFS的同源及进化分析 ．19 4．6 Rv0992c基因的PCR扩增和鉴定 2l 4．7重组质粒的构建及鉴定 ．．22 4．8重组质粒序列测定结果 22 4．9重组蛋白的表达 ．．23 4．10肱tuberculosis H37Rv Rv0992c基因产物的纯化 ．23 4．11重组蛋白的Western Bloting结果 ．25 4．1 2重组蛋白酶活性测定 ．25 r 第五章结论与展望 ．．28 5．1结论 28 ▲ 5．2到目前为止已经完成的工作 ．．28 5．3本文的创新之处 ．．28 5．4展望 28 参考文献 30 致谢 ．．34 发表论文及参加课题一览表 ．35 两南大学硕十学位论文 两南大学硕十学位论文 摘要 |L ．曼曼曼曼曼曼量曼皇曼曼皇曼曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼蔓舅曼皇曼曼 结核分枝杆菌叶酸代谢相关基因 ▲ Rv0992c的性质及功能研究 工． } 微生物与生化药学专业硕士研究生 侯曼美 指导老师 谢建平 研究员 摘1要 结核病严重危害人类的生命健康，其致病菌结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)感染过全世界近三分之一的人口。随着人们对结核分枝杆菌生物学 特征及生理代谢的了解，相继研发了链霉素、异烟肼、利福平等治疗性药物，但 是这些药物的不合理利用引起耐药分枝杆菌的出现。结核病控制工作中急需新型 药物的出现，所以寻找新的结核药物作用靶点及开发新型抗结核药物已成为当前 的热点和难点。这就需要加深对结核分枝杆菌生理代谢的了解。叶酸代谢是细菌 不可或缺的生理过程，其代谢途径中所涉及的某些酶的编码基因在结核分枝杆菌 中还不是很清楚。 本研究通过生物信息学方法对膨tuberculosis H37Rv的未知功能基因 Rv0992c的蛋白产物进行结构和功能的分析及预测，并对该基因进行克隆、表达 及蛋白产物酶学活性研究。从之前对深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)的研究 得知Rru A1084基因编码5一甲酰基一四氢叶酸环连接酶(5-formyltetrahydrofolate cyclo．1igase，也称为次甲基一四氢叶酸合成酶，MTHFS)。M tuberculos纽中Rv0992c 基因是Rru A1084的同源物(二者的氨基酸序列具有32．7％的相似性和21．8％的 同源性)，所以推测前者编码结核分枝杆菌的5一甲酰基一四氢叶酸环连接酶。从 GenBank数据库中获得膨tuberculosis H37Rv的Rv0992c的核苷酸序列，设计一 对引物，以M tuberculosis H37Rv全基因组为模板，PCR扩增获得Rv0992c基因。 通过TA克隆，将PCR产物连接到pMDl9．T Simple Vector上，之后亚克隆至载 体pET28上，经菌落PCR，质粒酶切以及核苷酸序列测序证明了成功的构建了重 组质粒pET28．Rv0992c。重组质粒转化Escherichia coli BL21(DE3)，以温度、 时间和IPTG浓度建立三因素三水平的正交实验，优化该重组蛋白质诱导表达条 件。以最佳表达条件(0．8mM的IPTG，25℃下诱导4h)进行扩大培养，Ni+凝胶 亲和层析柱纯化获得高纯度的重组Rv0992c蛋白。纯化蛋白的酶学活性通过反应 两南大学硕十学何论文 两南大学硕十学何论文 摘要 产物5，lO．次甲基一四氢叶酸在355n