结核杆菌ESAT6基因密码子优化真核载体的构建及其免疫效应的研究-病原生物学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 10 结核杆菌 ESAT6 基因密码子优化真核载体的构建 及其免疫效应的研究 中文摘要 目的：（1）构建结核杆菌 ESAT6 基因密码子优化核酸疫苗 pVAX1-ESAT6-O 和 ESAT6 天然密码子核酸疫苗 pVAX1-ESAT6。（2）原核表达 ESAT6 重组蛋白。（3） 评价 ESAT6 基因密码子优化核酸疫苗 pVAX1-ESAT6-O 和天然密码子核酸疫苗 pVAX1-ESAT6 的免疫效应。 方法：（1）培养结核分枝杆菌 H37Ra 菌株。（2）从结核杆菌 H37Ra 菌株中提取 DNA，设计引物，以此 DNA 为模板通过 PCR 技术扩增 ESAT6 基因。（3）ESAT6 基因与 pET42a（+）载体双酶切后的纯化产物在 T4 连接酶的作用下连接，构建 原核表达质粒 pET42a(+)- ESAT6，经菌落 PCR、单双酶切及 DNA 测序鉴定重组 质粒是否正确；鉴定正确的阳性菌株，转化至大肠埃希菌 BL21（DE3+）中,经 IPTG 诱导表达重组蛋白，采用 GST 和镍柱亲 和层析纯化重组 蛋白，通过 SDS和 Western blot 对目的蛋白进行分析和鉴定，大量纯化蛋白,去除内毒 素并用鲎试剂定性检测内毒素，便于后续试验。（4）酶切纯化的 ESAT6 基因和 pVAX1 空质粒经 T4 连接酶连接构建真核表达质粒 pVAX1-ESAT6，经菌落 PCR、 单双酶切及 DNA 测序鉴定重组质粒是否正确。（5）按照哺乳动物密码子使用偏 好，对结核分枝杆菌 ESAT6 基因进行优化，使用 GeneOptimizer 软件对 ESAT6 基因的氨基酸编码基因进行优化，但不改变氨基酸序列。优化后的基因序列，由 南 京 金 斯 瑞 生 物 公 司 合 成 ， 并 插 入 pVAX1 质粒 。（ 6 ） 分 别 大 量 提 取 pVAX1-ESAT6-O、pVAX1-ESAT6 和 pVAX1。首先，体外转染 Hela 细胞，并通 过 RT-PCR、间接免疫荧光检测其在真核细胞内的表达；其次，经肌肉注射并电 转染免疫小鼠，免疫组化观察小鼠骨骼肌瞬时表达效果。(7) pVAX1- ESAT6-O、 pVAX1-ESAT6 和 pVAX1 肌肉注射并电转染免疫 BALB/c 小鼠，3 次重复免疫后， 取脾脏制备小鼠脾淋巴细胞经 ESAT6 抗原刺激培养后，以流式细胞技术检测淋 巴细胞增殖水平和以 ELISPOT 检测分泌 IFN-γ 的特异性细胞免疫情况，并以间 接 ELISA 法检测免疫后血清中 IFN-γ 的水平和相应的特异性抗体及特异性抗体 动态变化等免疫指标。 结果： (1)构建的了 pET42a(+)-ESAT6 重组质粒经 PCR 和双酶切鉴定结果与预 期结果一致，DNA 测序鉴定结果经 BLAST 比对与标准株 H37Ra 基因组序列及 标准株 H37Rv 的 ESAT6 基因序列完全一致。pET42a(+)-ESAT6 阳性菌经 IPTG 诱导后，蛋白在 E.coli BL21(DE3)工程菌中大量表达，经 SDS分析为可溶 性表达，表达量占菌体蛋白的 30.5%。Western blot 显示重组蛋白能与 ESAT6 单 克隆抗体发生特异性免疫结合反应，经 ToxinEraserTM 去内毒素试剂盒进行去除 内毒素处理后，鲎试剂检测蛋白内毒素为阴性。（2）构建的 ESAT6 天然密码子 核酸疫苗 pVAX1- ESAT6 重组质粒经 PCR 和双酶切鉴定结果与预期结果一致， DNA 测序结果经 BLAST 比对插入基因序列与标准 H37Rv 株基因序列完全一致。 （3）获得了结核分枝杆菌 ESAT6 优化后的 ESAT6 基因序列，并全基因合成， 构建的 ESAT6 基因密码子重组质粒 pVAX1-ESAT6-O 经 PCR 和双酶切鉴定结果 与预期结果一致，DNA 测序结果经 BLAST 比对插入基因序列与设计的 ESAT6 优化密码子序列基因序列完全一致。（4）pVAX1-ESAT6-O 和 pVAX1-ESAT6 重 组质粒真核细胞转染后 RT-PCR 结果显示实验组均有相应的 mRN A 表达，间接 免疫荧光检测表明目的基因能在 Hela 细胞中表达蛋白，免疫组化检测结果发现 空白对照和空质粒组着色不明显，转染了重组质粒的小鼠骨骼肌纤维内均有着色 显著的棕黄色阳性颗粒。（5）免疫后各组小鼠淋巴细 胞增殖实验结果显示 pVAX1-ESAT6-O 组和 pVAX1- ESAT6 组 PI 值显著高于 pVAX1 组和 NS 组(p＜ 0.01），pVAX1-ESAT6-O 组显著高于 pVAX1-ESAT6 组 (p＜0.05），pVAX1 组和 NS 组无显著性