金黄色葡萄球菌烯醇酶Enolase的结构和功能研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

University University of Science and Technology of China A Dissertation for Doctor’S Degree Structu raI and Fu nctionaI Research of Staphylococcus au reuS ■_ EnOIaSe Author’S Name： Yunfei W-u Speciality： Biochemistry and Molecular Biology Supervisor：Prof．Jianye Zang Finished time： September,20 1 5 万方数据 万方数据 万方数据 中国科学技术大学学位论文原创性声明本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成 中国科学技术大学学位论文原创性声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成 果。除己特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或撰写 过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确 的说明。 作者签名：≠避 签字日期：互竺立二』出 中国科学技术大学学位论文授权使用声明 作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学拥 有学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交 论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入《中国学 位论文全文数据库》等有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存、汇编学位论文。本人提交的电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 口公开 口保密( 年) 作者签名：孚立l乏 导师签名： 签字日期： 万方数据 万方数据 摘要摘要 摘要 摘要 烯醇酶(Enolase)是在所有真核和原核生物细胞质中都存在的一种进化上 高度保守的极其重要的糖代谢金属酶，主要催化2．磷酸甘油酸(2．PG)脱水形 成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)。在合适的条件下，也可以催化该反应的可逆反应。 Enolase可以定位在一系列细胞的表面，包括癌症细胞、造血细胞、神经元细胞 和感染性致病菌。细胞表面的enolase可以作为纤维蛋白溶酶原(plasminogen) 的受体，通过激活纤维蛋白溶酶(plasmin)增强细胞纤溶活性，导致细胞外基 质的降解。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种致病性很强的典型 革兰氏阳性菌，在全世界范围内频繁地引起大规模的严重感染致病。此外，enolase 还是金黄色葡萄球菌RNA降解体中的一员。 在第一部分中，我们分别解析了金黄色葡萄球菌enolase分辨率为2．45 A的 apo结构和分辨率为1．6 A的PEP结合的复合物结构。晶体结构中enolase以八 聚体形式存在，但在溶液状态下enolase同时存在八聚体和二聚体两种状态。此 外，野生型和突变体enolase酶活实验显示只有八聚体具有催化活性，二聚体失 去催化能力。等温滴定量热(ITC)实验显示二聚体不能结合底物，而八聚体能 够结合底物。 RhlB(I斟A解旋酶B)是大肠杆菌5个DEAD．box解旋酶中的一个，它的 活性依赖于ATPaSe水解ATP以提供能量。RhlB的ATPase活性和RNA解旋能 力需要RNaseE参与协调。果蝇的DEAD．box解旋酶Vasa与单链RNA和 AMP．PNP(ATP类似物)的复合物结构为揭示RNA duplex解聚的机理提供了线 索，但是RNaseE和ATPaSe在这个过程当中的作用还不是很清楚。 在第二部分中，我们克隆，表达并纯化了大肠杆菌RhlB的全长蛋白和不同 片段截短体蛋白，并进行了晶体初次筛选，后续实验中尝试加入ssRNA和 AMP．PNP与目的蛋白共同结晶，但都没有使得目的蛋白成功结晶。在此基础上， 我们进一步设计纯化出了RhlB／RNaseE和RhlB／RNaseE／RraA两种蛋白复合物， 并用于结晶筛选。在RhlB／RNaseE／RraA复合物晶体生长过程中，只有RraA单 个分子出现在晶体中，RhlB和RNaseE并没有出现在结构中。我们还尝试了酶 解实验和交联实验。这些实验结果为将来对RhlB和RNaseE研究提供了一些线 索。 关键词：纤维蛋白溶酶原金黄色葡萄球菌Enolase二聚体八聚体大肠杆菌 RNA解旋酶B 摘要 II AbstractAbstract Abstract Abstract Enolase is a key evolutionary conserved glycolytic metalloenzyme in the cytoplasm of prokar