结核与非结核分枝杆菌多重PCR方法的建立及初步应用-兽医专业论文.docxVIP

Tuberculosis and non-tuberculous mycobacteria multiple PCR method to establish and Preliminary application A Dissertation Submitted to Shihezi University In Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Agriculture By Fang Yong ZHOU ( Basic Veterinary Medicine) Dissertation Supervisor: Prof. Xun Ma Submitted time: June 2013 Shihezi Xinjiang China 石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据 我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研 究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢 意 研究生签名: 1i1元永 时间 : }Q I 年 2 月 w 日 使用授权声明 本人完全了解石河子犬学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并 向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版.有权将学位论文在学校图书馆 保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有 权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 、古队们名 签 生 究研时间: H 、古队 们 名 签 生 究 研 切γJ.··名签师导时间 切γ J . ·· 名 签 师 导 I I 摘 要 为了避免结核检疫中 PPD 检测假阳性牛被错误的扑杀,预防奶牛养殖场结核病的流行扩散, 维护公共卫生安全 ,保障畜牧业经济的发展 ,本研究建立了可以区分结核与非结核分枝杆菌的多 重 PCR 方法,并以石河子地区部分牛场存栏奶牛以及养殖场麻雀为调查对象,进行了初步应用。 首先,进行分支杆菌标准株的复苏与培养。试验以结核分枝杆菌 H37Ra、卡介苗 BCG、禽 分支杆菌、胞内分支杆菌、偶发分支杆菌、耻垢分支杆菌、龟分支杆菌为分支杆菌标准菌,其中 H37Ra、BCG 总 DNA 取自医学院民族高发病实验室,并完成了分支杆菌主要培养基的配制、龟 分支杆菌冻干粉的复苏培养,禽分支杆菌、胞内分支杆菌、偶发分支杆菌、耻垢分支杆菌的培养。 其次,为了建立一种快速区分鉴定结核与非结核分枝杆菌的多重 PCR 方法,以分支杆菌属 特异基因 32kD,结核分枝杆菌种特异基因 MTP40 和结核分枝杆菌复合群特异基因 IS6110 为目 标基因,设计合成三对特异性引物,以结核分枝杆菌标准株 DNA 为模板,通过对 PCR 反应体系中 DNA 模板浓度、Mg2+ 浓度、dNTPs 浓度、引物浓度和 TaqDNA 聚合酶浓度 5 个因素的正交设 计,以及 PCR 反应条件中各反应参数的优化 ,建立了鉴别分支杆菌的多重 PCR 检测方法,并对该 方法的特异性、敏感性进行了验证。结果：该方法对结核分枝杆菌标准株 H37Ra 能扩增出 506bp、 396bp 和 984bp,对卡介苗（BCG）能扩增出 506bp 和 984bp 片段,对禽分支杆菌、胞内分支杆菌、 偶发分支杆菌、耻垢分支杆菌、龟分支杆菌能够扩增出 506bp 片段,对大肠杆菌等的扩增结果均 为阴性。建立的多重 PCR 敏感度最低可检出 6.6x10-6ng。结论：该方法具有特异性高、敏感性 好等特点,可用于奶牛结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的鉴别诊断。 最后,参照国家标准 GBT/18645-2002 进行奶牛结核病的皮内变态反应试验。PPD 试验共检 测奶牛 2624 头,其中阳性反应 35 头,阳性率 1.33%（35/2624）；采集皮试阳性牛粪便、鼻腔分 泌 物各 35 份,牛 场麻 雀 21 只,利 用多 重 PCR 进 行检 测 ,其 中粪 便分 支杆 菌阳 性率 8.57%（3/35, 含 1 例非结核分枝杆菌,2 例牛分支杆菌）,鼻腔分泌物阳性率 11.43%（4/35,含 2 例非结核分枝 杆菌,2 例牛分支杆菌）,其中仅 1 例皮试阳性牛粪便与鼻腔分泌物的分支杆菌检测结果均为阳 性。麻雀肺组织分支杆菌阳性率 9.52%（2/21,2 例均为非结核分枝杆菌）。将所有 PCR 检测阳 性样品进行涂片、染色、镜检、病原菌分离培养 ,仅 2 例麻雀样品染色可见少量抗酸杆菌 ,所