酒精耐受半纤维素降解菌筛选鉴定及相关基因克隆-遗传学专业论文.docxVIP

Classified Index: Q939 U.D.C.: 579 Dissertation for the Master Degree in Science SCREENING AND IDENTIFICATION OF AN ALCOHOL-STABLE HEMICELLULOSE DEGRADATION BACTERIUM AND CLONING OF XYNA GENE Candidate: Liu Duotao Supervisor: Prof. Yang Qian Academic Degree Applied for: Master of Science Speciailty: Genetics Affiliation: Life Science and Engineering Date of Defence: June, 2008 Degree-Conferring-Institution: Harbin Institute of Technology 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文 - - I - 摘要 利用秸秆生产酒精不但可以缓解能源危机，还能减轻粮食生产酒精造成的 粮食紧张问题。应用混合发酵方法降解秸秆生产酒精的过程中，酒精的积累会 对木质纤维素降解菌和降解酶产生抑制作用，目前很少有木质纤维素降解菌酒 精耐受性的报道，对木质纤维素降解酶的酒精耐受性更是几乎没有资料提及。 本实验针对木质纤维素降解菌的酒精耐受性问题，进行了菌种和木聚糖酶的一 系列研究。 通过筛选培养基和酒精平板实验等方法，筛选到一株能耐受一定浓度酒精 且可以高产木聚糖酶的细菌 DT83。经生理生化鉴定和 16SrDNA 鉴定，确定 DT83 为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。 为了研究短小芽孢杆菌 DT83 产木聚糖酶的发酵条件和酒精耐受度，本实 验首先对该菌的生长条件进行优化，得到了该菌的最适培养条件。然后对短小 芽孢杆菌 DT83 酒精耐受度分析得出：短小芽孢杆菌 DT83 在固体平板上可以耐 受 10%酒精，在液体培养基中可以耐受 8%酒精，明显好于大肠杆菌的酒精耐受 度，甚至达到某些酿酒酵母的耐受程度。 利用液体发酵培养对 DT83 的产木聚糖酶条件进行分析得出，短小芽孢杆 菌 DT83 产木聚糖酶的最适诱导碳源为木聚糖，最佳单因子氮源为蛋白胨，最 适产酶温度为 28℃，最适培养基 pH 值为 8.5 左右。实验选取 4 种氮源进行正交 优化分析得出最佳的氮源组合为蛋白胨 0.2%、酵母粉 0.4%、硝酸铵 0.4%、硫 酸铵 0.6%。DT83 所产的木聚糖酶最适温度为 50℃，最适 pH 值为 6.5。木聚糖 酶的酒精耐受性分析得出，在 5%的酒精溶液中该木聚糖酶依然可以保持 90%以 上的活性，在 10%的酒精溶液中可以保持 75%以上的酶活，这是该领域首次提 及酶的酒精耐受性问题。 本实验克隆到了 DT83 的木聚糖酶基因(xynA)，序列分析结果表明这是一条 新的序列。将 xynA 构建到 pET-28a(+)载体上转化大肠杆菌(E. coli)BL21 进行非 融合表达。对转化子分泌胞外木聚糖酶的产酶条件分析得出：转化子产木聚糖 酶的高峰在 48 h~60 h，并且转化子的较高产酶能力可以保持 20 d 以上；转化子 产酶的最佳 IPTG 诱导浓度为 0.02 mmol/L，最适产酶温度为 25℃~28℃；转化 子木聚糖酶活最高可达到 250 IU 以上，其中胞外可达到 208 IU。该转化子胞外 酶活远远超过其他木聚糖酶外源表达的胞外酶活，为目前报道的国内外最高水 - - II - 平。利用 SDS分析转化子表达木聚糖酶情况得出：转化子胞内在 4 h 即 可表达出目的蛋白，胞内目的蛋白表达量在 12 h 达到高峰；从 SDS电泳 图可以看出转化子分泌的木聚糖酶分子量与短小芽孢杆菌 DT83 分泌的木聚糖 酶分子量大小一致，与蛋白预测的 22.7 kD 相符。 本文对产木聚糖酶的菌株和木聚糖酶在酒精耐受方向的研究，为利用木质 纤维素生产酒精开辟了一个新的研究方向。同时，本试验研究了木聚糖酶基因 的克隆和表达，实验得到的转化子能高效的合成木聚糖酶，并且大量分泌到胞 外，胞外酶活值在该方向上处于国内外领先的水平，为木聚糖酶基因工程菌在 工业上的应用迈出了重要的一步。 关键词 短小芽胞杆菌；木聚糖酶；发酵条件优化；酒精耐受性；非融合表达 - - PAGE VIII - Abstract Producing alcohol from stalks can relieve grain shortage as well as alleviate energy crisis