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miRNA功能筛选鉴定 文章来源：丁香园 尽管目前在各种物种中发现了成千上万个miRNA，但已经鉴定功能的miRNA却少之又少。miRNA通常与靶基因mRNA 3 UTR区发生相互作用，进而关闭或抑制基因的表达，30%的基因表达受miRNA调控，影响到细胞增殖，细胞凋亡，细胞分化及相关信号通路等生命过程。 一、miRNA功能筛选方法 高内涵筛选（High Content Screening， HCS）是一种能够进行荧光显微成像和定量图像分析的自动化筛选技术，能够在细胞水平进行系统性定量分析，利用各种荧光标记物（如Hoechst、GFP、荧光抗体等）来检测各类药物对细胞作用的多维信息，分析特殊分子靶位和生物特征，是药效结构发现、药物靶标确认、RNAi筛选、药物先导物优化和药物毒性评价的技术平台。 二、miRNA功能研究工具： 1）miRNA mimic micrONTM miRNA mimic是运用化学方法合成的miRNA模拟物，能模拟细胞中成熟miRNA的高水平表达，以增强内源miRNA的调控作用，进行功能获得性（gain-of-function）研究。 2）miRNA inhibitor micrOFFTM miRNA inhibitor是化学合成的，经过特殊修饰的miRNA抑制剂，通过特异性地与成熟miRNA分子结合而抑制其作用，可以削弱细胞中miRNA导致的调控作用，从而进行miRNA功能缺失性（loss-of-function）研究。可以用来筛选miRNA靶位点，筛选调控某一基因表达的miRNA，筛选影响细胞生长、增殖等过程的miRNA。 3）miRNA agomir micrONTM miRNA agomir是经过特殊化学修饰的miRNA激动剂，通过模拟内源性miRNA进入miRISC复合物来调节靶基因mRNA的表达而发挥作用。与普通的miRNA mimic相比，miRNA agomir在动物体内具有更高的稳定性和miRNA活性，更易通过细胞膜，组织间隙而富集于靶细胞。在动物实验中可以用全身或局部注射等方法进行给药，作用效果持续时间可长达6周。 4）miRNA antagomir micrOFFTM miRNA antagomir 是经过特殊化学修饰的miRNA拮抗剂，通过与体内的成熟miRNA竞争性结合，阻止miRNA与其靶基因mRNA的互补配对，抑制miRNA发挥作用。 miRNA antagomir均为miRNA成熟链的反向互补序列，全链进行甲基化修饰，在5 端和3 端分别有2个和4个碱基硫代修饰，并在3 端连接有高亲和性胆固醇修饰。与普通抑制剂相比，micrOFFTM miRNA antagomir在动物体内外具有更高的稳定性和抑制效果，更易通过细胞膜、组织间隙而富集于靶细胞。miRNA antagomir在细胞实验中转染效率更高，甚至不需要转染试剂，从而避免了转染试剂包装过程的复杂步骤及其对实验的影响。在动物实验中可用全身或局部注射等方法进行给药，作用效果持续时间可长达6周。 三、miRNA功能分析方法 1）miRNA过表达选择依据 2）miRNA抑制方法的选择 3）基因表达谱芯片 miRNA通常与靶基因mRNA 3 UTR序列发生相互作用，导致关闭或抑制靶基因的表达。由于miRNA作用方式的特殊性，其可能与多个基因发生调控作用，进而影响到其他基因的表达变化。基因表达谱芯片可以大规模、高通量地分析各种生物过程变化中基因表达变化的全面信息。