免疫荧光步骤.docxVIP

免疫荧光步骤 1.脱蜡和水化?? ???脱蜡前，应将组织切片在室温中放置60min或60℃恒温箱中烘烤20min。?????1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min；????2）无水乙醇中浸泡5min；?3）95%乙醇中浸泡5min；?????4）70%乙醇中浸泡5min；?（动作要快，减少暴露在空气中中的时间） 2.PBS洗两次各5min。?（整个过程中注意切片不能干） ?3.抗原修复，用于多聚甲醛固定的石蜡包埋组织芯片。煮沸热修复电炉或者水浴锅加热???0.01M柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10min，必须等缓冲液冷却后，方能将切片取出。? 4.PBS洗3次每次5min。? ?5.滴加5%正常山羊血清，室温封闭30min，甩去多余液体。? ?6.滴加一抗（根据说明书的比例稀释，一般为1:100），室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45min）。??? ?7.PBS洗3次每次5min。? ?8.滴加荧光标记的二抗，室温避光孵育1h。（注意抗体针对的种属，使用浓度，用锡箔纸包住培养板放在抽屉中避光。） ?9.PBS洗3次每次5min。? ?10.?DAPI染色：把DAPI滴在片上，将切片覆盖，50ul/片，染色10min。 ?11.?PBS洗3次每次2?min。? 12.封片：?抗荧光淬灭封片剂