膜片钳实验技术入门基本原理与操作.pdfVIP

膜片钳实验技术入门基本原理与操作 关兵才 李国华 刘理望 按：本文乃于 2003 年根据较旧型号的仪器写成，后被《机能实验科学》 （郑先科主编，北大医学版，2006）收入。因 新旧仪器基本原理和操作步骤大同小异，现对原文略作修改和标注，供同学们参考。 【实验目的】 1. 了解膜片钳技术的基本原理和操作。 2. 初步学习电压依赖性离子通道电流的基本记录方法。 【实验原理】 一、膜片钳技术原理简介 膜片钳(patch clamp)是一种主要用于检测细胞膜离子通道活动的电生理技术，按工作 方式可区分为电压钳(voltage clamp)和电流钳(current clamp) 。电压钳是最基本的工作方式， 即对细胞膜电位进行人为控制，如将膜电位钳制于某一固定水平，或在此基础上再施以阶跃 (step)式或斜坡式(ramp) 电压刺激，同时记录跨膜电流，从而分析细胞膜通道的活动。电流钳 即人为控制经微电极对细胞进行注射的电流（等于离子通道电流与细胞膜电容电流之和）， 同时记录膜电位及其变化。若注射电流为零即常用的零位钳流，用于测量细胞膜静息电位， 若注射方波脉冲刺激电流，用于诱发、观测动作电位。另外，膜片钳技术还常用于观测细胞 膜电容, 从而推测分泌细胞的活动情况。下面主要介绍其电压钳工作方式的基本原理。（注： 在电生理资料中，因通常将细胞外液和记录系统的“地”点相连作为参考点即零电位点，所以电位和电压 两个概念经常混用。） 根据膜片钳实验中受检细胞膜的型式（configuration）不同，又可将膜片钳分为全细 胞式(whole-cell)、细胞贴附式(cell-attached 或 on-cell)、内面朝外式(inside-out)、 外面朝外式(outside-out)等四种模式。 (一)全细胞式 1．电压钳制和电流记录的实现 图 9-9 为全细胞式膜片钳工作原理示意图。 图 9-9 全细胞膜片钳实验原理示意图 A ：运算放大器；A ：单倍增益差动放大器；R ：反馈电阻；V ：电极电位（A 反向输入端电位）； 1 2 f p 1 V ：A 同向输入端电位；C ：输入端杂散电容；C ：电极电容；Rs ：串联电阻；C ：细胞膜电容；R ： c 1 in p m m 细胞膜电阻；Em ：细胞膜内在电位(指钳压时的细胞膜诸通道状态决定的内在Goldman-Hodgkin-Katz平衡 电位) ；V ：A 输出端电位；V-offset ：偏移电位补偿电位；C ：用于电容补偿的电容；V (app)：表观钳制 o 2 c c 电压即欲施加于受试膜片的电压；图中 ⊕ 和 表示求和电路 将充有电解质溶液的玻璃微电极（glass microelectrode或 recording pipette ）利用负压紧密吸 9 Ω）级高阻封接， 进一步对微电极内施加负压、将 附于细胞表面，形成吉欧即千兆欧（10 细胞膜吸破，形成全细胞膜片钳记录模式。玻璃微电极内的电解质溶液通过Ag/AgCl 电极与 探头的信号输入端（从信号钳制角度讲也是输出端）相连接，细胞浴液通过Ag/AgCl 电极与 探头的信号地端相连接。膜电位的人为钳制，乃靠高开环放大倍数、低偏流、低噪声的运算 放大器（以下简称运放）A1在深度负反馈工作状态下的“虚短路（virtu