抗结核分枝杆菌多种抗原的抗体检测蛋白芯片开.doc

PAGE PAGE 1 抗结核分枝杆菌多种抗原的抗体检测蛋白芯片开 　　朱中元王海波谢勇刘爱国　　发现结构病已经100多年了，对其研究、控制、治疗的成功曾使人们乐观地预言本世纪末即将消灭结核病。1970年后的近20年，在美国及工业化国定结核病平均以每年6%速度下降[1]，出现了使之成为罕见病的良好趋势。但是80年代末期（AIDS）的流生使结核病猛然复活，如今世界上有1/3的人感染结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis结核菌），每年有800万新结核病患者出现，300万人死于结核病[2]。我国现有结核病人约450万例，每年病死近20万人[3]。造成上述严峻形势的重要原因之一是结核病的早期快速诊断技术不理想，目前已有的结核抗体检测试剂均为未纯化的结核菌菌液抗原，存在特异性差异的问题[4，5]。我们使用基因工程表达的结核菌蛋白16和38KDa蛋白以及脂阿拉伯甘露糖（LAM）生产了抗结核分枝杆菌多种抗原的抗体检测蛋白芯片系统（简称：结核芯片系统），并进行了临床应用试验，取得较理想的快速诊断效果。报告如下。 　　材料与方法 　　1．血清标本来源：结核病人血清由海南省农垦总局医院、武汉钢铁公司第二职工医院和海口市结核病防治提供，共226份。其中活动性肺结核（痰涂片或者细菌培养结核菌阳性）病人血清113份，慢性肺结核病人血清90份，结核性胸膜炎、结核性脑膜炎、肾结核病人血清23份。正常对照血清：海南省农垦总局医院住院非结核病人血清148份，门诊健康体检者血甭469份，共617份，武汉钢铁公司总医院提供活动性结核病人血清，共130份。正常对照血清：武汉钢铁公司总医院住院非结核病人血清184份，门诊健康体检者血清549份，共733份，哈尔滨市胞科医院提供活动性肺结核病人血清104份，正常对照血清96份（均为门诊体检者血清）。 　　2．结核菌纯化抗原：结核菌脂阿拉伯甘露糖（LAM）美国MossmanAssociates公司生产。批号：17AM2A9022，基因工程表达的结核菌38KDa和16kDa蛋白：由美国Fitzgerald公司提供，批号分别为：AO2061902和 　　3．金标记抗人IgG抗体：南京大渊生物技术工程有限公司制备。 　　4．点样机：台湾然精密股份有限公司制造的EzspotSR-A101型Biospot生物芯片打点机。 　　5．点样抗原的最适工作浓度及临界值的确立：最适工作浓度确定时先将抗原稀释成不同浓度，先与结核病人血清和正常对照血清反应，再与不同浓度的金标记第二抗体反应，显色能取得最高的敏感性和特异性者为最适工作浓度的抗原点样，与一定数量的政党对照血清标本反应后，芯片识别读数仪测定其灰度值，计数抗原及标准差，均数与2倍标准差和即为临界值，各抗原与标本中的抗体、金标记二抗反应得到了灰度值大于或者等于临界值者为阳性。否则为阴性。 　　6．蛋白芯片的制备：将上述结核菌抗原分别稀释成适当浓度，用点样机点样于硝酸纤维滤膜上，制成方阵，然后切成合适大小的小片，在滤膜的下方垫上一定的吸水材料，装上膜板，使之成图标的芯片，该系统命名为结核菌多抗原的IgG抗体芯片检测系统（简称：结核芯片系统）。实验用批号：PBT-TBO1A472672和PTB-TBO1A472961。 　　7．结核抗体DIGFA检测试剂：上海奥普生物医药有限公司（简称：上海奥普）生产的结核TB-BOT○R试剂。生产文号：国药证字批号失效日期检测方法和结果判断按试剂说明书。 　　8．蛋白芯片阅读仪：南京大渊生物技术工程有限公司自主设计生产，型号：PBT-X2。 　　9．芯片系统操作步骤：按照芯片作用说明书和芯片识别阅读仪说明书进行。 　　10．数据处理：采用独立样本卡方检测判别各组间是否有显著性差异，P＜0.05即认为差异有显著性。 　　结果 　　一、结核蛋白芯片系统的操作步骤：经过挑选不同的缓冲液、不同的离子强度、去垢剂和各种试剂的反应时间，在取得最佳敏感性、特异性节省试剂等方面，如下工作程序可得到上述要求：A.在芯片上标记上样品编号。B.在芯片盒窗口内滴加4滴试剂A，使膜表面完全浸湿。C.待完全渗入后，室温放置一分钟，加等检血清100ul。D.待血清完全渗入后，再滴加6滴试剂B。E.等试剂B完全渗入后，滴加10滴试剂C。F.等试剂C完全渗入后，最后滴加6滴试剂D。G.反应完毕后30分钟内。将芯片放入芯片阅读系统进行分析。阴阳结果根据南京大渊生物技术工程有限公司生产的芯片识别仪器设置参数自动判别，该检测方案也作为我们向用户推荐的实验方案。 　　二、3种抗原的最适点样浓度和胶体金使用的浓度：将结核菌的三种肮原分别稀释成不同的浓度，然后与不同的稀释倍数的胶体金的