实时荧光PCR检测单个细胞地贫基因突变.doc

PAGE PAGE 1 实时荧光PCR检测单个细胞地贫基因突变 高华闫宗合芮德蓉李巍何蕴韶 【摘要】目的建立基于TaqMan探针的实时荧光PCR法检测单个细胞地贫基因突变的技术方法。方法分离已知基因型的外周血标本单个淋巴细胞，用巢式PCR外引物进行第一轮扩增，第二轮用TaqMan探针进行相应基因型的实时PCR检测，其中不同荧光报告基团标记的探针分别与正常、异常等位基因特异杂交，结合各荧光的终点变化及其实时动力学曲线判断对应等位基因存在与否。SEA缺失型α地贫基因用常规TaqMan探针实时PCR检测，β地贫基因用TaqMan-小沟结合物（minorgroovebinder,MGB）探针实时PCR检测。结果对3种地贫基因突变的不同基因型标本分别进行了单细胞检测试验，各种基因型均可通过结合相应荧光的终点变化及其实时动力学曲线进行判断。单细胞扩增效率均在95%以上，杂合子的等位基因扩增丢失（alleledropout,ADO）率在3.3%~8.1%之间，假阳性率在5%以下。结论基于TaqMan探针的实时荧光PCR能够快速、特异、准确地检测单个细胞标本的相应地贫基因型。 【关键词】实时荧光PCR；地中海贫血；单个细胞 胚胎植入前遗传诊断（preimplantationgeneticdiagnosis,PGD）[1-4]和用母体血中富集的胎儿有核红细胞进行产前诊断均对单细胞分子诊断技术有较高要求，发展单细胞PCR技术平台是必不可少的环节。单细胞PCR过程中应尽可能地控制污染，而基于TaqMan探针的实时荧光PCR是在反应体系完全封闭的情况下实时检测PCR扩增动力学变化，能有效防污染，且具快速、特异性高的优势[5，6]。TaqMan-MGB探针实时荧光PCR可有效用于检测基因的点突变[7]。α地贫SEA缺失型和β地贫CDs41/42(-CTTT)和IVS-2nt654(C→T)突变型是我国南方分布最广、危害最大的单基因遗传病分子基础[8]。我们拟建立针对上述3种致病突变的基于TaqMan探针的实时荧光PCR技术检测平台，以达到能对单个细胞模板的地贫基因突变进行分子检测的目的。 1材料和方法 1．1材料 1．1．1标本地贫外周血标本来源于我中心、中山大学中山医学院医学遗传学教研室、中山大学附一院生殖医学中心等。SEA缺失型α地贫携带者经3套不同位点引物的PCR检测系统和部分标本测序验证；CDs41-42(-CTTT)和IVS-2nt654(C→T)型β地贫标本经反向斑点杂交（reversedotblot,RDB）和DNA测序验证。 1．1．2引物检测SEA缺失型α地贫基因的Gap-PCR内外引物由美国IntegratedDNATechnology公司合成，外引物序列为：5′-TTTTGAGACGATGCTTGCTTTGTCAC-3′；5′-GATCTGGGCTCTGTGTTCTCAGTATTGG