RNA病毒扩增检测的质控品和标准品研究进展.doc

PAGE PAGE 1 RNA病毒扩增检测的质控品和标准品研究进展 李金明卫生部北京医院，卫生部临床检验中心，100730，北京RNA病毒如丙型肝炎病毒（HCV）、人免疫缺陷病毒(HIV)、严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）等的核酸检测对于感染的早期诊断和抗病毒治疗疗效的动态观察具有重要价值。自1983年发明聚合酶链反应（PCR）技术以来，出现了基因扩增的概念。目前多采用核酸扩增技术（NAT）来检测病毒RNA，最常用的是逆转录（RT）-PCR方法。核酸扩增检测要想得到可靠的结果，必须要使用质控品进行严格的质量控制，要对病毒进行定量测定，通常还须有病毒RNA标准品。目前RNA病毒扩增检测的质控品和标准品可分为两大类，一是裸露的RNA片段，二是内含特定RNA的病毒样颗粒或称之为带盔甲的RNA(armoredRNA)。一、裸露的RNA裸露的RNA即没有任何蛋白包裹的RNA片段。其通常将特定的RNA病毒拟扩增RNA的cDNA经体外转录的方式进行构建后，得到一种与相应cDNA互补的RNA（cRNA）。cRNA的构建方法基本上是首先将所需的RNA逆转录为cDNA，再经PCR扩增后，产物DNA片段经T载体克隆入相应的质粒载体，然后再构建入含T7启动子的载体，体外逆转录得到相应的cRNA[1-5]。这种裸露的RNA即可用作为相应RNART-PCR测定的质控品和定量标准品。裸露的RNA构建方法简单，可通过OD260nm波长下比色进行准确定量。其缺点是：（1）稳定性差，难于保存[1-3]。cRNA片段完全暴露于外界环境中，很容易被环境中的核糖核酸酶（RNase）所降解。（2）cRNA由相应模板DNA逆转录产生，原有模板DNA的“污染”很难通过加DNase消化去除[5]。（3）不能监测样本中RNA病毒颗粒的裂解效率。cRNA直接暴露于样本溶液中，无法模拟和监测真正的病毒颗粒的核酸提取过程[1-5]。由于上述原因，cRNA质控品和标准品很难在临床RNA病毒RT-PCR检测中实际应用，目前仅限于一些文献报道[1-5]。二、内含特定RNA的病毒样颗粒或带盔甲的RNA(armoredRNA)已知某些RNA病毒如MS2噬菌体、烟草花叶病毒（TMV）的外壳可以耐受RNase的作用，因此，如将特定的RNA序列包裹到这些病毒外壳内，就可以使其免受环境中RNase的降解，同时，在应用过程中还可以模拟病毒颗粒监测核酸提取过程中的病毒裂解效率。1．包裹于MS2噬菌体包膜蛋白内的RNAMS2噬菌体属于正极性单链RNA球形病毒，基因组全长3569碱基对，编码成熟酶蛋白、包膜蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白等四种蛋白质分子。噬菌体由180包膜蛋白单体、一分子成熟酶蛋白和一分子基因组RNA组成。在较早期的大肠杆菌病毒——MS2噬菌体包膜蛋白的研究中，发现包膜蛋白与操纵子RNA序列有特异性相互作用，这种作用可引发噬菌体外壳的组装，同时，将噬菌体基因组RNA包装到包膜内。因此，如果将特定病毒RNA的cDNA克隆于MS2噬菌体包膜蛋白基因序列cDNA下游，并在其下游插入终止子，转录后得到带有噬菌体操纵子RNA序列的特定病毒RNA转录本，随后操纵子RNA序列就可以引发噬菌体包膜蛋白组装成外壳，并将携带有特定病毒RNA序列的部分噬菌体基因组包装到包膜内，构成噬菌体病毒样颗粒。在构建质粒表达载体时，需将噬菌体成熟酶蛋白、包膜蛋白基因序列cDNA克隆表达于表达载体启动子下游，经过诱导表达后，所表达的包膜蛋白不仅仅作为病毒样颗粒的结构成分，而且可作为基因表达调节因子和pac信号对表达过程进行调节，使包膜蛋白的表达和RNA的转录协调一致，组装所得噬菌体样颗粒具有成熟特性，从而具有RNase抗性[6-7]。国外及我们的研究[8-13]将编码MS2噬菌体相应蛋白的cDNA序列连接到表达载体如pET28bT7启动子下游，经过诱导表达得到成熟酶蛋白和包膜蛋白，在成熟酶以及噬菌体基因组RNA片段的协同作用下，组装得到了耐RNase的病毒样颗粒。据此，我们成功构建了表达载体pINCCL，并经原核表达后，得到的病毒样颗粒具有耐RNase的特性[12]。我们将HCVRNA[13]、HIVRNA和SARS-CoVRNA等的cDNA序列构建于该质粒载体中的MS2噬菌体1.9kb基因组下游，经转化细菌表达后，即可得到具有耐RNase的特性的内含特定RNA的病毒样颗粒。现我们亦已完成构建肿瘤标志物如前列腺特异抗原（PSA）和甲胎蛋白（AFP）的mRNA的病毒样颗粒的表达载体。由于pINCCL表达载体的通用性，可以预见其在涉及RNA的标准品和质控品的研制中将具有极为广阔的应用前景。2．包裹于烟草花叶病毒（TMV）包膜蛋白内的RNA将特定的病毒RNA序列的cDNA与烟草花叶病毒（TMV）的包膜基因序列c