海带种质超低温保存技术的研究.pdfVIP

中国农业科学院硕士学位论文 第一章绪 论 第一章绪论 1．1课题提出的背景及研究意义 海带是重要的经济藻类，在化工、食品、医药等方面具有广泛的用途，尤其在中国，海带养 殖已经成为海水养殖业中规模最大的产业，因此在种质研究上给予了较多的关注。丰富的种质资 源是渔业生产的重要物质基础，保护和利用好海带种质资源将为提高海带品种水平、实现海带良 种化生产提供重要保证，使我国这一具有传统优势的重要产业在新世纪仍然保持世界领先水平。 海带生活史包括肉眼可见的孢子体和显微可见的配子体两个世代，其中配子体世代包括游孢 带的种质保存是将配子体分离培养形成无性繁殖系(vegetativegametophytes)，并在实验室中继 变异的可能性。 1．2国内外研究现状 Aresch)是中国重要的经济藻类，养殖产量和规模连续多年居世界 海带(Laminariajaponica 首位。丰富的种质资源是渔业生产的重要物质基础，保护和利用好海带种质资源将为提高海带品 种水平、实现海带良种化生产提供重要保证，使我国这一具有传统优势的重要产业在新世纪仍然 保持世界领先水平。 1．2．1海带种质保存的现状 体世代是海带的单倍体阶段，在该阶段将雌配子体(female 雄配子体分离培养在中国首先获得成功，为保护海带种质奠定了技术基础。经三十多年的发展取 得了显著成效：(1)目前已在青岛、烟台等地建立起了多处种质细胞库，基本实现了海带种质的 人工室内保存；(2)通过继代培养，在优化的温、光、盐等培养条件下，建立了使无性繁殖系处 于旺盛生长状态的保种技术；(3)保存的种质材料包扩国内的十几个良种以及日本海、欧洲北海 的少量原种，另外还有相当数量的特殊性状株系；(4)基本实现了种质的长期保存，保存时间最 长的已达二十年以上。 但是，这种传统保存技术具有明显的不足：(1)液体培养是唯一的保存途径，手段单一，限 制了保存的规模和效率；(2)液体培养保存一般需要在半月内更新一次培养液，工作量大，操作 繁琐，频繁操作也增加了种质污染及混杂的机会；(3)采孢子前无法对种海带进行无菌处理，整 个保存过程都在有菌条件下，不能彻底杜绝微生物尤其杂藻的污染；(4)培养中细胞形态异常、 单性生殖等现象时有发生，培养因子有待进一步优化。因此，目前的保种技术还不能作到种质永 中国农业科学院硕士学位论文 第一章绪 论 久保存，无法完全排除混杂、污染、变异的可能性。 低温生物学(cryobiology)是探索低温条件下生命现象的特征和规律，以及保存生物体、细 胞的一门科学。生物细胞、组织、器官、胚胎甚至个体在超低温(．196℃)状态下代谢完全停止， 生命以静止的形式可以在这种状态下长期保存，解冻后又可恢复其原有的生物活性和遗传特性。 因此，低温生物学技术在生物医学、优生学及畜牧、兽医和水产等领域均具有重要意义和应用价 值。以液氮为冷媒，研究水生动物、藻类和微生物的细胞超低温保存技术是建立水生生物种质资 源的细胞库、胚胎库和基因库的基本技术。将有效解决藻类种质保存中污染、混杂、变异的问题， 可望实现藻类种质的永久保存。 1．2．2．1藻类冷冻保存的主要进展 藻类种质超低温保存的研究开始于20世纪60年代，80年代以后发展速度较快，从淡水藻类 到海水藻类，从微藻类到大型藻类，从非经济藻类到经济藻类都给予了较多的关注。 1．2．2．1．1保存方法日益改进 不稳定，却是对藻类超低温保存的首次尝试，后来Tsum对该方法进行了改进，在保存材料中加 入甘油或DMSO(二甲基亚枫)后投入液氮中保存，获得了较高的存活率(王起华等，1978)。 70年代以后，两步冰冻法(two-stepfreezing)是超低温保存的主要方法，该方法首先在保存材料中 加入抗冻保护剂，进行预冻，再将预冻过的材料投入液氮中快速冷冻(李广武等，1998；Ben-Amotz Aet 2000；HkamKet a1．，1996；VigneronT，et a1．，1997)，是对藻类超低温保存技术的又一发展。 1．2．2．1．2对提高超低温保存成活率进行了广泛的研究 在两步法保存中，适宜的抗冻保护剂选择和使用可减小对