rt-qPCR实验操作课件.pptxVIP

荧光实时定量PCRrt-qPCR;定义 实时荧光定量PCR(rt-qPCR)： 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化对PCR过程进行 实时监控，以此实现对初始模板的定量分析。 ;Rt-qPCR的应用;PCR基本原理;基本步骤 变性：加热使双链DNA变为单链（94℃，30s） 退火：降温使引物和互补模板在局部形成杂交链 （55℃，30s） 延伸：耐热DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物为起始点的延伸反应（70~72℃，30~60s）;示意图;Real-time定量PCR仪是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测和连续地分析整个PCR进程，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线，最后通过标准曲线对未知模板进行定量的分析。;SYBR Green ;理论上来说，PCR反应过程中生成的DNA产物是呈指数方式增加的，即每增加一个循环，PCR产物加倍。但随着反应循环??的增加，产物积累、原料消耗，最终PCR反应无法继续维持指数方式的扩增，而进入线性期和平台期。整个PCR反应过程中，只有在指数期，PCR产物的量与加入的初始模板量存在明确的数学关系（PCR产物量=初始模板量×2^N，N=循环数），因此，利用公式，可以由产物的量精确推算出初始模板量的多少。而在线性期和平台期，PCR产物量和初始模板量之间不存在准确的数学关系，由这两个时期的产物量来推算初始模板量的多少是不准确的。;在相同的条件下，进行复制扩增，每扩增一个循环，通过检验荧光来检测每个孔里目标基因片段的含量，记录每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数（样本的域值循环数Ct），次数越多就说明目标基因在原本的样品里越少，即初始模板的量越少。; logX= n (1+E)+logX0 ;实验步骤; ;荧光定量PCR如何减小误差;1、校准生物学误差内参(管家基因) ;2、降低随机误差: 重复实验 ;