油葵脂肪酸去饱和酶基因HaFAD2-1的克隆与功能鉴定.pdfVIP

江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆ Ａｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０１７ꎬ３３(２):２７３~２７９ ｈｔｔｐ:/ / ｗｗｗ.ｊｓｎｙｘｂ.ｃｏｍ ２７３ 何早柯ꎬ周茜萍ꎬ王梦瑶ꎬ等. 油葵脂肪酸去饱和酶基因ＨａＦＡＤ２￣１的克隆与功能鉴定[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０１７ꎬ３３(２):２７３￣２７９. ｄｏｉ:１０.３９６９/ ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０１７.０２.００６ 油葵脂肪酸去饱和酶基因ＨａＦＡＤ２￣１ 的克隆与功能 鉴定 何早柯ꎬ　 周茜萍ꎬ　 王梦瑶ꎬ　 朱新霞ꎬ　 祝建波ꎬ　 孙　 黎 (石河子大学生命科学学院/ 农业生物技术重点实验室ꎬ新疆 石河子 ８３２０００) 　 　 摘要:　 为研究油葵ＦＡＤ２￣１基因在脂肪酸合成中的催化功能ꎬ利用ＲＴ￣ＰＣＲ技术ꎬ从油葵品种新葵杂４号未成 熟种子中克隆ＨａＦＡＤ２￣１基因的全长ｃＤＮＡ序列ꎮ 将该基因序列构建穿梭表达载体ｐＹＥＳ２￣ＨａＦＡＤ２￣１ꎬ并转化到营 养缺陷型酿酒酵母菌株ＩＮＶＳｃ１中ꎮ 将重组酵母诱导培养后对其总脂肪酸进行ＧＣ￣ＭＳ分析ꎮ 结果显示ꎬＨａＦＡＤ２￣１ 基因编码一个长３７８个氨基酸的脂肪酸去饱和酶蛋白ꎬ分子质量４３ ７１９ꎬ等电点(ｐＩ)为８.３８ꎬ具有３个高度保守的 组氨酸簇ꎮ 脂肪酸甲酯气相色谱分析结果表明ＨａＦＡＤ２￣１基因在酿酒酵母中获得表达ꎬ能将油酸转化为亚油酸ꎬ证 明克隆得到的ＨａＦＡＤ２￣１具有完整的催化功能ꎮ 关键词:　 油葵ꎻ 脂肪酸去饱和酶ꎻ 基因克隆ꎻ 酿酒酵母转化ꎻ 功能分析 中图分类号:　 Ｓ５６５.５ꎻＱ７８５　 　 　 文献标识码:　 Ａ　 　 　 文章编号:　 １０００￣４４４０(２０１７)０２￣０２７３￣０７ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ ｇｅｎｅꎬ ＨａＦＡＤ２￣１ꎬｆｒｏｍ ｏｉｌ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ＨＥ Ｚａｏ￣ｋｅꎬ　 ＺＨＯＵ Ｘｉ￣ｐｉｎｇꎬ　 ＷＡＮＧ Ｍｅｎｇ￣ｙａｏꎬ　 ＺＨＵ Ｘｉｎ￣ｘｉａꎬ　 ＺＨＵＪｉａｎ￣ｂｏꎬ　 ＳＵＮ Ｌｉ (Ｋｅｙ Ｌａｂ ｏｆ ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ/ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ ＳｃｉｅｎｃｅꎬＳｈｉｈｅｚｉ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＳｈｉｈｅｚｉ ８３２０００ꎬＣｈｉｎａ) 　 　 Ａｂｓｔｒａｃｔ:　 Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆ ｏｉｌ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒＦＡＤ２￣１ｇｅｎｅｉｎｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓꎬａｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｏｆ ＦＡＤ２ ｎａｍｅｄＨａＦＡＤ２￣１ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｓｅｅｄｓ ｏｆ Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ Ｌ. Ｘｉｎｚａ ４ ｂｙ ＲＴ￣ＰＣＲ. Ｔｈｅ ＨａＦＡＤ２￣１ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｅｓａ￣３７８ａａｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅｗｉｔｈｐｒｅｄｉｃｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ ｏｆ４３７１９ꎬｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｐｏｉｎｔ (ｐＩ)ｖａｌｕｅｏｆ ８.３８ ａｎｄ ｔｈｒｅｅ ｈｉｓ￣ｂｏｘｅｓ.ＨａＦＡＤ２￣１ｇｅｎｅｗａｓ ｓｕｂ￣ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｓｈｕｔｔｌｅ ｖｅｃｔｏｒ ｐＹＥＳ２ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒ ｐＹ￣ ＥＳ２￣ＨａＦＡＤ２￣１ｗｈｉｃｈ ｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏａｄｅｆｅｃｔｉｖｅｍｕｔａｎｔＩＮＶＳｃ１ｓｔｒａｉｎｏｆＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｆｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ.Ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｙｅａｓｔｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙ ＧＣ￣ＭＳａｆｔｅｒｉｎｄｕｃｅｄｃｕｌｔｕｒｅ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｙｅａｓｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｖｅｃｔｏｒ ｐＹＥＳ２￣ＨａＦＡＤ２￣１ｃｏｕｌｄ ｃａｔａｌｙｚｅｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｉｎｔｏｌ