杜氏盐藻MAR序列结合蛋白的原核表达与功能初步分析.pdfVIP

郑州人学2007年硕十论文 杜氏盐藻MAR序列结合蛋白的原核表达及功能初步分析 I和NdeI双酶切，纯化回收线性载体片段后， 同样对pET-28a(+)载体进行EcoR 用T4DNA连接酶连接目的基因片段和线状载体，构建杜氏盐藻MARs序列结合 取质粒，用EcoRI和NdeI双酶切鉴定，测序确定读码框是否正确。 1．2杜氏盐藻MARs序列结合蛋白在大肠杆菌中的表达 将经鉴定读码框正确的重组原核表达载体pET-MBP转化大肠杆菌工程菌株 BL21，挑选阳性菌落，接种到5mL卡那霉素浓度为50mg／L的LB培养基中， 37。C振荡培养12h，按照1：100的比例接种到新的卡那霉素浓度为50 mg／L的 0．2mM，继续培养并分别于I，2，4，6，8h，离心收集菌体l 1× ml，加入100lal 凝胶上样缓冲液，100℃水浴煮沸3 达情况。 1．3Westernblotting鉴定重组杜氏盐藻MARs序列结合蛋白的表达 His tag)，利用抗6×histag抗体(北京普利莱基因技术有限公司)为一抗和山羊 抗小鼠IgG(北京中山生物技术有限公司)为二抗，对表达的重组蛋白进行 Western blotting．分析，检测重组蛋白在BL21中表达情况。 2结果 2．1杜氏盐藻原核表达载体的构建 酶切鉴定以及序列测定结果表明，基因插入方向正确，没有发生读码框易位，原 核表达载体pET-MBP构建成功。 2．2杜氏盐藻MARs序列结合蛋白在大肠杆菌中的表达 果显示重组蛋白在大肠杆菌中得到了高效的表达，融合蛋白分子量大小约为 75KD。 2_3Western blotting鉴定重组杜氏盐藻MARs序列结合蛋白的表达 KD处有特异条带，证明含有6×his blotting分析。结果显示在75 tag的融合蛋白 郑州人学2007年硕十论文 杜氏盐藻MAR序列结合蛋自的原核表达及功能初步分析 已经表达。 三、杜氏盐藻黼s结合蛋白的纯化及功能分析 1方法 1．1重组蛋白的纯化 离心收集经IPTG诱导培养的细菌，用蛋白纯化试剂盒中的结合缓冲液重悬 菌体，高压细胞破碎仪破碎细胞，1,5×105kPa的压力条件下持续1h。之后10000 min分离上清和沉淀。按照试剂盒说明书操作纯化蛋白。 rpm离心15 1．2生物素3’末端标记探针 生工合成的DNA序列，作为探针，并检测探针标记效率。 1．3凝胶滞留试验(ElectrophoreticMobil埘ShiftAssays，EMSA) 凝胶滞留试验可以检测DNA与其特异性结合蛋白相结合状态。利用以上步 骤的纯化后的融合蛋白和标记好的探针，使蛋白质和DNA发生特异性结合，在 非变性的聚丙烯酰胺凝胶中电泳后，检测其迁移率的变化。 2结果 2．1重组蛋白的纯化 重组蛋白经Ni—NTA Buffer洗脱 spin column亲和层析柱纯化之后，用Strip 之后可以得到较高纯度的蛋白，电泳结果显示，纯化后蛋白约占总蛋白含量的 70％。 2．4生物素3t末端标记探针 探针标}己效率良好，可供以下试验使用。 2．5凝胶滞留试验 凝胶滞留试验结果表明，在大肠杆菌BL21中表达的杜氏盐藻MARs序列结 合蛋白并不能与标记的探针发生特异性的结合。 四、结论 1．本研究成功克隆了杜氏盐藻MARs序列结合蛋白基因cDNA序列编码区，全 长为1623 上登录的序列具有99％的同源性，与其他物种的MARs序列结合蛋白也具有 4 郑州人学2007年硕士论文 杜氏盐藻MAR序列结合蛋白的原核表达及功能初步分析 较高的同