RT-LAMP技术检测烟草环斑病毒的研究【开题报告】.docVIP

毕业论文开题报告 食品质量与安全 RT-LAMP技术检测烟草环斑病毒的研究 选题的背景与意义 烟草环斑病毒（Tobacco ringspot virus，TRSV）是中国进境检疫法规中明确规定禁止入境的危害性有害生物。该病毒寄主范围广，可侵染52科246种植物，是果树、蔬菜、花卉等经济作物的重要病害之一，发生严重时可导致绝产。中国进口的植物种球茎和苗木中携带该病毒的风险很大。 国内外针对TRSV所用的检测技术主要有DAS-ELISA和RT-PCR技术。相比传统的电镜观察和生物学鉴定，这2种方法在检测周期方面具有明显的优势，操作快速简便和高通量。但是，DAS-ELISA的检测周期仍然需要6 h左右，且检测灵敏度相对较低，假阳性较高；RT-PCR的整个检测周期仍需4 h左右，且需要特殊的PCR扩增设备、电泳设备和紫外成像设备，仪器昂贵，对人员技术能力要求较高，不利于技术向基层实验室的推广及现场检疫。 环介导等温扩增技术（Lamp-mediated isothermal amplification,LAMP）作为一种新的核酸扩增方法，依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具解旋功能且呈瀑布式扩增的Bst DNA酶，在等温条件下可高效、快速和特异地扩增靶序列。该方法扩增效率非常高，灵敏度高，特异性强，只要恒温水浴锅即可，扩增结果加入荧光染料后可用肉眼直接观察，无需特殊仪器，操作方便，对设备要求低，LAMP的整个反应周期只需1.5~2.5 h，检测周期非常短。 本研究的建立，将提供一种快速简便检测烟草环斑病毒的方法，使该病毒乃至动植物种的其他病毒、细菌及真菌的基层实验室检测和现场检疫成为可能。 二、研究的基本内容与拟解决的主要问题： 本研究旨在建立用RT-LAMP技术检测植物中的烟草环斑病毒的方法。整个研究内容包括：(1)、设计RT-LAMP技术检测烟草环斑病毒的引物序列；(2)、确定RT-LAMP技术检测烟草环斑病毒的最佳温度；(3)、确定RT-LAMP技术检测烟草环斑病毒的最佳反应时间；(4)、检验本研究设计的引物在植物病毒检验中的特异性；(5)、比较常规的RT-PCR方法和本研究建立的方法检测烟草环斑病毒的灵敏度；(6)、检验用荧光染料SYBR green I判断实验结果的准确性；(7)、检验本研究建立的方法在样品检验中的应用。 三、研究的方法与技术路线： 针对本研究的内容设计研究方法和技术路线如下： (1)、查阅文献，建立初步的烟草环斑病毒的RT-LAMP检测方法； (2)、根据GenBank（）中已登录的烟草环斑病毒的外壳蛋白基因序列(D12477)，设计F3、B3、FIP（F1c＋TTTT+F2）、BIP（B1c＋TTTT＋B2）、Loop1和Loop2共6条引物； (3)、按照建立的烟草环斑病毒的RT-LAMP检测方法，设置58℃、60℃、63℃、65℃四个反应温度进行温度优化试验； (4)、按照建立的烟草环斑病毒的RT-LAMP检测方法，在最佳温度条件下，设置30 min、60 min、90 min三个反应时间进行时间优化试验； (5)、用烟草环斑病毒、南芥菜花叶病毒、香石竹环斑病毒、黄瓜绿斑驳病毒、番茄环斑病毒以及马铃薯V病毒等几种常见的植物病毒RNA进行特异性试验； (6)、用10－1、10－2、10－3、10－4和10－5稀释的烟草环斑病毒RNA样品为模板，用常规的RT-PCR方法和本研究建立的RT-LAMP方法进行扩增灵敏度比对试验； (7)、用凝胶电泳和荧光染料SYBR green I两种方法判断灵敏度试验中的RT-LAMP扩增产物，比较荧光染料SYBR green I判断实验结果的准确性； (8)、用已用DAS-ELISA检测呈TRSV阳性的进境大豆样品，采用本研究建立的RT-LAMP方法进行扩增检测，结果采用SYBR green I染色观察，检验该方法在样品检验中的应用。 四、研究的总体安排与进度： (1)、烟草环斑病毒的RT-LAMP检测方法的初步建立。2010年12月15日至2010年12月25日。 (2)、RT-LAMP技术检测烟草环斑病毒的引物序列的设计。2010年12月26日至2010年12月31日。 (3)、RT-LAMP技术检测烟草环斑病毒的温度优化试验。2011年1月3日至201年1月9日。 (4)、RT-LAMP技术检测烟草环斑病毒的时间优化试验。2011年1月10日至2011年1月16日。 (5)、本研究设计的引物在植物病毒检验中的特异性检验试验。2011年1月17日至2011年1月23日。 (6)、常规的RT-PCR方法和本研究建立的方法检测烟草环