分子生物学大实验-生科专业15学时课程设计.pptVIP

07级生物科学专业 2009.8;课程要求;分子生物学主要技术;1、质粒DNA的提取及其酶切检测 质粒DNA提取技术（碱裂解法） 限制性内切酶酶切技术 电泳技术（琼脂糖凝胶电泳） 2、聚合酶链式反应（PCR） 反应体系的构建 反应程序的设计 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测;质粒DNA的提取及其酶切检测;质粒复制和转录或多或少依赖于宿主编码的酶和蛋白质。 质粒分为严紧型和松弛型，我们现在使用的许多质粒（如PUC系列）多属松弛型质粒，能复制到很高的拷贝数，只要将培养物放在合适的培养基中生长到对数晚期，就可以用于质粒提取。;掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理； 掌握质粒DNA的中小量提取方法； 掌握限制性核酸内切酶酶切DNA的原理和方法； 掌握质粒DNA酶切分析的方法。;实验原理;克隆载体pUC19质粒图谱;试剂 LB液体培养基 STE溶液：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris.Cl，1mmol/LEDTA pH8.0 溶液I???50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl，10mmol/LEDTA pH8.0 溶液II：0.2mol/LNaOH，1%SDS，现用现配（0.4mol/LNaOH和2%SDS 等量混合）。 溶液III：5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml 氯仿：异戊醇=24：1 无水乙醇 70%乙醇 10×限制酶缓冲液 限制酶EcoRI pUC19;1、从选择性培养基平板上挑取单菌落，移至含有相应抗生素的10mlLB液体培养基中，于37℃振荡培养过夜。 2、将培养物转移到一个15mL的试管中，4000rpm离心10min。 3、弃上清，将细菌沉淀重悬于1mlSTE溶液中，剧烈振荡，充分悬浮，将悬浮液转移到1.5ml离心管中， 8000rpm离心5min。 。 4、弃上清，将细菌沉淀重悬于200ul预冷的溶液I中，剧烈振荡，充分悬浮。 5、加400ul新配制的溶液II到悬液中，盖紧管口，快速颠倒离心管数次，混合内容物，将离心管置于冰上。 6、加300ul预冷的碱裂解液III，盖紧管口，反复颠倒数次，使之在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，然后将离心管置于冰上3-5min。;7、8000-10000rpm，4℃离心5min，转移上清（约600ul）到一新的离心管中。 8、加等体积的氯仿（酚：氯仿），通过剧烈振荡混合有机相和水相，8000-10000rpm，4℃离心2min，转移上清到另一离心管中。 9、室温下加入600ul异丙醇以从上清中沉淀核酸，剧烈振动混合液，于室温下放置2min。 10、 8000-10000rpm，离心5min，收集核酸沉淀。 11、小心弃上清，将离心管倒置于吸水纸上，将液体吸干，加1ml70%乙醇洗涤沉淀。 12、 8000-10000rpm，离心2min；小心弃上清，将离心管置于超净台上吹干。 13、用100ul含有（20ug/ml）RNaseA的TE溶液重新溶解核酸，温和振荡，37℃保温40min。（略） 14、取20ul电泳观察并照相。 （略） 15、加灭菌双蒸水，将体积补至1ml，重复步骤7-12。 （略） 16、将沉淀溶于60-100ul灭菌双蒸水中，取5ul进行酶切分析（2份），取20ul电泳观察并照相。;17、取0.2ml离心管，配制酶反应混合液，每20ul反应体系包含： 10×限制酶缓冲液 2ul 限制酶EcoRI 1ul ddH2O 12ul 混匀。 18、加入5ul pUC19，混匀（离心机） 。 19、37℃保温30-45min。 20、加入上样缓冲液，1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果（以未酶切质粒做对照）。;聚合酶链式反应（PCR）;实验原理 在目的基因两端人工合成两段已知序列的寡核苷酸引物（通常两个引物序列不同），分别与模板DNA进行加热变性，随之将反应混合液冷却至某一温度，使引物与它的靶序列复性，复性引物在DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）作用下，以四种脱氧核苷酸为底物，以待测目的基因为模板，得到延伸。 如此反复进行高温变性、低温退火和中温延伸（denaturation-annealing-polymerization）三个步骤，模拟生物体内DNA复制扩增过程（一般25-30cycles）。每个循环扩增产物又可作为下一个循环的模板，因此理论上每完成一个循环，特定DNA片段的分子数目增加一倍，多轮扩增的结果使目的DNA片段以指数方式迅速积累，从而得到大量目的基因的新拷贝。;试