分子生物学实验技术课程设计.pptVIP

变性 在第一轮循环前，在94℃下变性5-10min非常重要，它可使模板DNA完全解链。 变性不完全，往往使PCR失败，因为未变性完全的DNA双链会很快复性，减少DNA产量。 一般变性温度与时间为94℃ 1min。 在变性温度下，双链DNA解链只需几秒钟即可完全，所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。 对于富含GC的序列，可适当提高变性温度。但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。 退火 引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成、引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度。 一般当引物中G、C含量高，长度长并与模板完全配对时，应提高退火温度。退火温度越高，所得产物的特异性越高。 实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5℃。 通常退火温度和时间为37℃-55℃，1-2min。 退火一般仅需数秒钟即可完成，反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。 延伸 延伸反应通常为72℃，接近于Taq DNA聚合酶的最适反应温度75℃。 实际上，引物延伸在退火时即已开始，因为Taq DNA聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃。 延伸时间的长短取决于目的序列的长度和浓度。 在一般反应体系中，Taq DNA聚合酶每分钟约可合成2kb长的DNA。 延伸时间过长会导致产物非特异性增加。 但对很低浓度的目的序列，则可适当增加延伸反应的时间。 一般在扩增反应完成后，都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应，以获得尽可能完整的产物，这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。 循环参数 一般而言，25-30轮循环已经足够。循环次数过多，会使PCR产物中非特异性产物大量增加。 通常经25-30轮循环后，反应中Taq酶已经不足。 如果此时产物量仍不够，需要进一步扩增，可将扩增的DNA样品稀释103-105倍作为模板，重新加入各种反应底物进行扩增，这样经60轮循环后，扩增水平可达109-1010。 在扩增后期，由于产物积累，使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线，产物不再随循环数而明显上升，这称为平台效应。 平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。 因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，减少非特异性产物。 四、PCR产物的纯化 酚/氯仿法 Kit法 酚:氯仿:异戊醇抽提2次 PCR产物 加TE100μl 混匀 回收水相 沉淀DNA 无水乙醇沉淀 纯化DNA 75％乙醇洗涤沉淀 ddH2O 溶解DNA 五、PCR产物的克隆 利用T-Vector克隆 Taq DNA聚合酶会在3’-端加上多余的非模板依赖碱基，而且对A优先聚合，所以PCR产物末端的多余碱基大部分都是A。 利用这一特点，可以经限制酶切割产生的平末端用酶加上dT或ddT，使载体与PCR产物末端互补并进行连接。 粘性末端连接 利用引物中附加在5’端的限制酶位点，直接将PCR产物经适当的限制酶切割后产生粘性末端，与载体连接，产生重组DNA。 如果上、下游两个引物中含有两个不同的限制酶位点，经酶切后定向克隆到载体中。 第三章 DNA酶切及凝胶电泳 一、DNA的限制性内切酶分析 Ⅱ类限制性内切酶 识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列。 Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段。 如，SmaⅠ：5‘-CCC↓GGG-3’ 有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端。 如，EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 5…G↓AATTC…3 →5… G AATTC…3‘ 3…CTTAA↑G …5 →3… CTTAA G…5 酶切反应 单酶切：各种酶缓冲液、反应温度不同 如，BamHⅠ反应温度为30℃ 双酶切：缓冲液不同，反应温度为37℃。 若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。 酶切时保护碱基的个数 二、琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。 琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度200bp至50kb的DNA片段。 琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。 在电场中，带负电荷的DNA向阳极迁移，其迁移速率由多种因素决定： DNA的分子大小 线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。 琼脂糖浓度 一个给定大小的线状DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移