海带提取物对百草枯诱导秀丽线虫氧化应激损伤的保护作用分析-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

安徽医 安徽医科大学硕士学位论文 I I 中文摘要 活性氧(reactive oxygen species, ROS)是机体正常代谢的中间产物，有氧生物会 不可避免地暴露在 ROS 环境中。正常生命体能够依靠机体内的抗氧化系统来维持 活性氧的动态平衡。当机体受到各种刺激时，如饥饿、电磁辐射、高原低氧等， 机体内的氧化和还原失去平衡而产生大量活性氧，一旦超出了机体能承受的抗氧 化能力，活性氧就直接攻击生物大分子如蛋白质、脂肪及核酸等，导致机体组织 的氧化应激(oxidative stress)损伤，诱发神经退行性疾病、肿瘤、炎症等多种疾病。 因此，清除机体中多余活性氧是防治此类疾病的重要策略。研究发现，一些天然 植物提取物具有潜在的抗氧化活性，可成为治疗此类疾病的候选药物。本文选择 海带提取物等几种天然植物提取物进行体外抗氧化活性评价，并且选择海带提取 物在秀丽线虫中进行抗氧化活性评价，旨在为活性氧损伤相关疾病提供新的干预 策略。主要研究结果如下： 一、海带提取物等四种天然提取物的抗氧化/还原能力和清除自由基活性比较 目的：体外实验比较海带提取物(Laminaria japonica Extract，ELJ)、猴头菇多糖 (Hericium erinaceus Polysaccharides ， HEP) 、马尾藻多糖 (Sargassum pallidum Polysaccharides，SPP)、牛膝糖肽(Achyranthes bidentata Glycopeptide，ABG)四种天 然植物提取物的总抗氧化能力、还原能力、清除超氧阴离子能力的差异，寻找体 外抗氧化活性较强的植物提取物。 方法：总抗氧化能力测定采用 FRAP 法，其原理是酸性条件下抗氧化物可以还原 Ferric-tripyridyltriazine(Fe3+-TPTZ) 产生蓝色的 Fe2+-TPTZ ， 随后在最高吸收峰 593nm 处测定蓝色的 Fe2+-TPTZ 即可获得样品中的总抗氧化能力。还原能力测定 采用铁氰化钾还原法，其原理是通过测定待测抗氧化剂转化 Fe3+为 Fe2+的能力得到 待测抗氧化剂的还原能力。清除超氧阴离子采用的检测方法是 NBT-光还原法进行, 该反应中 VB2 和 EDTA 在光照下发生反应，产生超氧阴离子，超氧阴离子与 NBT II II 发生反应，在 560nm 处有最大吸收峰。在反应体系中加入植物提取物，若植物提 取物与超氧阴离子反应，则会阻止超氧阴离子与 NBT 反应，在 560nm 处吸收峰会 发生变化，根据植物提取物与超氧阴离子反应的程度即可计算植物提取物清除超 氧阴离子活性能力。 结果：海带提取物(ELJ)、猴头菇多糖(HEP)、马尾藻多糖(SPP)、牛膝糖肽(ABG) 四种天然植物提取物的总抗氧化能力由强到弱依次为 ELJ、HEP、SPP、ABG。还 原能力由强到弱依次为 HEP、ELJ、ABG、SPP。清除超氧阴离子活性由强到弱依 次为 ELJ、HEP、ABG、SPP。综合比较，可见 ELJ 具有较强的体外抗氧化活性， 后续针对该种提取物进行深入研究。 二、海带提取物对百草枯诱导秀丽线虫氧化应激损伤的保护作用研究 目的：建立秀丽线虫百草枯(PQ)氧化应激损伤模型，选择体外抗氧化活性较强的 海带提取物(ELJ)进行秀丽线虫体内抗氧化活性评价实验。 方法：利用秀丽线虫制备 PQ 氧化应激损伤模型。利用海带提取物干预该模型秀丽 线虫，通过体长(body size)、成虫率、产卵等指标进行抗氧化效果评价；通过检测 ROS 水平、凋亡及氧化应激相关差异基因的表达来研究海带提取物保护机制。 结果：海带提取物能恢复线虫 PQ 损伤后的体长变短，提高线虫成虫率、产卵率， 降低线虫体内的 ROS 水平，减少线虫生殖腺细胞的凋亡数目，并且能通过影响体 内抗氧化基因 daf/sod 发挥抗氧化作用。 三、不同状态大肠杆菌 OP50 对秀丽线虫生长发育的影响 目的：比较不同方式灭活处理的食物菌——大肠杆菌 OP50 对线虫生长发育的差 异，寻找合适的线虫食物菌的灭活方法，避免活体 OP50 菌对实验的干扰。 方法：根据实验室现有条件，选择 65℃热灭活和钴 60 γ 射线照射两种灭活的线虫 食物菌的方式分别和正常活菌作对照，比较各组线虫生长发育情况，体长差异， 产卵数量变化，以及不同处理的食物菌的琥珀酸脱氢酶的活性变化。 结果：用两种方式灭活的 OP50 菌饲喂线虫后，线虫的生长发育出现显著差异，热 灭活的菌导致线虫生长速度降低，而钴 60 γ 射线照射的菌对线虫生长发育没有影 PAGE PAGE VI 响；噻唑蓝(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di- phenytet