广西巴马小型猪PERV全基因扩增与分析及cDNA克隆的构建-预防兽医学专业论文.docxVIP

I I 广西巴马小型猪 PERV 全基因扩增与分析及 cDNA 克隆的构建 摘 要 使用猪源器官进行异种移植被认为是解决当前人源供体器官短缺，治 疗终末期器官疾病的有效方法之一。而广西巴马小型猪是采用闭锁纯繁近 交方式选育的广西地方特有的小型猪品种，是一种遗传稳定，性状优良的 实验动物，可作为异种移植的理想器官供体。但是，由于广西巴马小型猪 体内普遍存在猪内源性逆转录病毒（Porcine endogenous retrovirus, PERV）， 能够以前病毒 DNA 形式整合进宿主细胞基因组中，并随细胞染色体复制而 复制。PERV 在体外可以感染多种人源细胞的发现，引起了人们对异种移 植安全性的广泛关注。因此，有必要开展广西巴马小型猪 PERV 的基础研 究，了解其感染机制，以评估 PERV 的病原安全性。 本研究采用 PCR 技术，扩增获得 4 条覆盖广西巴马小型猪 PERV 全基 因的重叠片段，经拼接获得 1 条完整的广西巴马小型猪 PERV（PERV-BM） 全基因序列，大小为 8774 bp。遗传进化分析表明 PERV-BM 属于 PERV A 亚型；序列分析发现，PERV-BM 的 5′ UTR 的启动子和增强子区域分别位 于 400-467 bp 与 313-432 bp 位置；对推导氨基酸序列分析则发现病毒的 env 蛋白中含有 15 个可能的抗原表位，其跨膜区位于 600-622 aa 位置，含有 Ser、 Thr 和 Tyr 磷酸化位点的数量分别为 20、7 和 9 个，并含有 10 个可能的糖 基化位点。利用分子钟假说对 PERV-BM 的 3′ LTR 及本实验扩增的另外 8 条 PERV-BM 的 3′ LTRs 进行分析，结果表明 PERV-BM 大约进化于 7.1×106 年前。 在完成全基因测序的基础上，本研究进一步构建了 PERV-BM 全基因 II II cDNA 克隆。将 4 个覆盖全基因组的重叠基因片段通过 pMD 18-T 中间载体 依次连接并克隆到 pBluescript II SK (-)载体上，构建 cDNA 克隆。将该 cDNA 克隆与 GenBank 登录所有 PERV 全序列进行比对分析，发现存在 15 个保守 碱基的突变。为消除这些突变位点在下一步病毒拯救中造成的潜在影响， 通过定点突变和化学合成的方法成功恢复 15 个突变碱基。将突变后的 PERV-BM 全长序列上传 GenBank，登录号为 HM159246。同时为便于鉴定， 本研究还在所构建 cDNA 克隆上引入突变，将 BM-PERV 全长 cDNA 克隆 第 8408 位碱基由 A 突变为 C，引入新的单一酶切位点 Aat II，获得了 cDNA 克隆的突变株。经 Not I/Nhe I、Nhe I/Cal I、Not I/ Cal I 酶切及全长测序鉴 定，证实所构建的 cDNA 克隆为 PERV-BM 全基因的 cDNA 克隆，命名为 pBluescript II SK-PERV-BM。接着通过反向遗传的方法构建了 PERV-BM 感 染性 cDNA 克隆并对其进行了初步鉴定，为从 DNA 水平上探索 PERV 的感 染机制以及感染人源细胞后的复制、转录等过程打下坚实基础。 关键词：广西巴马小型猪 猪内源性逆转录病毒 全基因组扩增 基因分析 cDNA 克隆 PAGE PAGE VI AMPLIFICATION AND ANALYSIS OF THE WHOLE GENOME OF PERV STRAIN FROM GUANGXI BAMA MINIPIG AND CONSTRUCTION OF ITS FULL-LENGTH COMPLEMENTARY DNA CLONE ABSTRACT Using pigs as the transplant source in xenotransplantation has the potential to tackle the severe shortage of human organ donors, and is now considered to be one of the valid measures for treating end-stage organ diseases. Mini pigs in Bama, Guangxi, a locally specific variety which breed by way of inbreeding within enclosed environment, are excellent animals for lab experimentation with genetic stability and