广州管圆线虫不同发育时期差异蛋白表达的研究-临床检验诊断学专业论文.docxVIP

温州医学院硕士学位论文 温州医学院硕士学位论文 广州管圆线虫不同发育时期蛋白差异表达的研究 中文摘要 广州管圆线虫病(angiostrongyliasis cantonensis)，是由广州管圆线虫 (Angiostrongylus cantonensis)幼虫侵害人的中枢神经系统引起的，是一种人兽 共患寄生虫病。寄生虫需要通过改变宿主来完成其生活史，因此，他们有根据宿 主环境来调节基因的差异表达的能力。广州管圆线虫生活史的完成需要几个不同 的宿主。成虫寄生在正常宿主大鼠体内，大鼠可排出I期幼虫，I期幼虫经水进 入中间宿主如福寿螺等软体动物体内，并发育成为Ⅲ期幼虫；Ill期幼虫感染大鼠 后，穿过血脑屏障发展成Ⅳ、V期幼虫，再移行至心、肺部血管内发育成成虫。 蛋白质组学已经成为研究蛋白质结构、功能和相互作用以及基础生物学的典 范，可以从整体层次上，更精确、贴切地反映蛋白质的表达情况。而线虫是最好 的研究模式生物之一。差异蛋白质组学主要用于筛选和鉴定不同种类和状态下各 样本蛋白质组之间的区别和变化，寻找任何能引起样本间差异蛋白质谱的有意义 的因素，从而能进一步认识个体生理的发展与变化。双向荧光差异凝胶电泳相对 于传统的双向电泳能够避免胶与胶之间的变异并提高敏感性，在发育生物学和组 织蛋白质组学研究中更显其优势。本研究运用双向荧光差异凝胶电泳和质谱相结 合的蛋白质组学技术分析鉴定广州管圆线虫不同发育时期的差异表达蛋白质。 目的 1．应用蛋白质组学双向荧光差异凝胶电泳和质谱技术分析鉴定广州管圆线虫ⅡI 期幼虫、V期雌雄虫和雌雄成虫的差异表达蛋白质。 2．建立一个稳定的广州管圆线虫不同发育时期蛋白质组的双向荧光差异凝胶电 泳图谱，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术对广州管圆线虫不同 发育时期的差异表达蛋白质进行质谱分析和鉴定，建立一个可靠的蛋白质组 学生物技术。 3．探讨可能与广州管圆线虫不同发育时期的生长发育相关的蛋白质，可以为宿 主环境在寄生虫发育过程中的调控或宿主一寄生虫相互作用中的关键蛋白质 提供依据。 方法 1．广州管圆线虫虫体的收集：实验室条件下建立广州管圆线虫生活史，分别于 感染的不同时期收集广州管圆线虫ⅡI期幼虫、V期雌虫、V期雄虫、雌成虫 温州医学院硕士学位论文 温州医学院硕士学位论文 和雄成虫，虫体用0．01 mol／L PBS缓冲液洗涤3次后，-80。C冻存。 2．蛋白样品的制备：将收集的虫体分别使用裂解液裂解、超声裂解、离心，获 得的上清，使用Bio．Rad protein assay reagent测定蛋白质浓度。分装后-80。C 低温保存。 3．CyDye染料标记蛋白质：分别用Cy3或Cy5标记样品，Cy2标记内标。 4．双向荧光差异凝胶电泳(2D．DIGE) 4．1第一向等电聚焦(IEF) 4．2胶条的平衡 4．3第二向SDS．PAGE电泳：12．5％的SDS．PAGE凝胶 5．双向荧光凝胶电泳的图像扫描：利用U]VIax Powerlook 21 10XL和Typhoon FLA9000对电泳后的胶板图像扫描，得到不同颜色的扫描图。 6．DeCyder 7．0图像分析 7．质谱鉴定：胶内酶解，抽提酶解肽段，ZipTip脱盐，MALDI．TOF．MS鉴 定、数据库检索 结果 1．对广州管圆线虫5个样品及内标进行双向荧光差异凝胶电泳后，得到了清晰 的蛋白质表达谱。用UMax Powerlook 21 10XL和Typhoon FLA9000激光扫描 仪于荧光模式下进行Cy2、Cy3、Cy5激光扫描，8块张胶共得到24张荧光 扫描图谱。 2．经过DeCyder 7．0软件分析，校准后，蛋白表达差异值经统计学分析(f检验)， 筛选出在24张图谱中均出现的点共183个蛋白点。与成虫相比，314、537、 698、925和980这5个蛋白点在V期幼虫中表达上调，但没有表现出显著的 性别差异；与IⅡ期幼虫相比，点469、488、609、855、859、885、1253、1520 和1416等89个蛋白点在成虫和V期幼虫中上调，相反的，点623、730、1053、 1161和1060等13个蛋白点在IⅡ期幼虫中出现明显上调；雌雄虫及V期幼虫 雌雄比较中，点1496在雄虫和V期幼虫雄虫中均表达上调。 3．质谱分析差异蛋白点，获得肽质量指纹图谱(PMF)，经数据库检索，鉴定了 其中37个蛋白质。10．81％是细胞骨架相关蛋白，如肌动蛋白和副肌球蛋白； 64．86％功能蛋白与代谢过程、免疫反应和转录调控相关，如热休克蛋白和变 换域相关蛋白；24．32％是未知的蛋白质。这些差异表达蛋白在细胞黏附、细 胞凋亡、炎症反应、蛋白质水解、抗氧化和免疫调节等许多生理和病理过程。 4．与V期雌虫相比，过氧化物氧还蛋白