海洋嗜杀酵母的筛选、嗜杀因子的纯化及其基因的克隆-海洋生物专业论文.docxVIP

海洋嗜杀酵母的筛选、嗜杀园子的纯化及其基园的克隆海洋嗜杀酵母的筛选、嗜杀因子的纯化及其基因的克隆 海洋嗜杀酵母的筛选、嗜杀园子的纯化及其基园的克隆 海洋嗜杀酵母的筛选、嗜杀因子的纯化及其基因的克隆 摘要 通过人工感染实验确定了酵母菌WCY为梭子蟹的病原菌，感染实验的梭子 蟹的症状同梭子蟹“乳化病”症状相同；通过形态、生理生化和分子生物学鉴定， 鉴定病原酵母菌WCY为梅奇酵母(Metschnikowia bicuspidata)。 从海洋中分离的327株酵母中筛选出13株对病原酵母WCY有抑制作用的 嗜杀酵母，对其掷菌效果傲了比较，其中菌株YFOTo具有最佳的抑菌效果。通 过生理生化和分子生物学方法对海洋嗜杀酵母进行鉴定，结果显示在海洋嗜杀酵 母中，汉逊德巴利酵母(Debaryornyees hansenii)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guflliermond$$)、酱鲁兰类酵母(Aureobasidium pullulans)和异常毕赤酵 母(Pichia anomala)最常见，其中异常毕赤酵母(Pichia anomala)的抑菌能 力最强。 研究了菌株YF07b的嗜杀因子在不同NaCl浓度(O％，3％，6％，8％)、温 度(15，20，25，30，35℃)、pH(4．0，4．5，5．0，6．0，7．0，8．O)值条件下的抑菌效 果。嗜杀因子的最佳作用条件是NaCI浓度8％、pH为4．5，培养温度为15℃。 研究了菌株YF07b的发酵培养条件，结果表明当海洋嗜杀酵母YF07b在温 度为20C，培养基中NaCl浓度为2．O％，pH为4．5时产生嗜杀因子的能力最强。 分离筛选的海洋嗜杀酵母YF07b经常规生理生化反应和分子生物学鉴定， 为异常毕赤酵母(Pichiaanomala)，根据陆地嗜杀酵母Pichiaanomala strainK的 嗜杀因子(B．1，3．葡聚糖酶)的基因及相关序列设计引物克隆菌株YF07b的嗜 杀因子基因序列，克隆得到的基因序列为1559bp，GenBank登录号为EF029071。 与其它相关蛋白序列对比分析，确定此嗜杀因子基因的编码区(ORF框)为209 bp 到1492bp。克隆基因的推导蛋白为427个氨基酸，推导蛋白与其他酵母菌相关 蛋白的氨基酸序列的系统发育分析比对，与异常毕赤酵母(Pichiaanomala Strain K)的亲缘关系最近。信号肽分析结果表明。推导蛋白的前17个氨基酸为信号 肽 嗜杀因子经Sephadex G75凝胶过滤和DEAE—Sephorose Fast Flow阴离子 交换得到纯化，经SDS．PAGE检测得到分子量为47kDa的单一条带。纯化后的 海洋嗜杀酵母的筛选，嗜杀因子的纯化及其基因的克隆嗜杀因子有8．1，3．葡聚糖酶活性，并且纯化后的嗜杀因子仍具有抑菌活性。 海洋嗜杀酵母的筛选，嗜杀因子的纯化及其基因的克隆 嗜杀因子有8．1，3．葡聚糖酶活性，并且纯化后的嗜杀因子仍具有抑菌活性。 纯化的嗜杀因子的最适作用温度为40℃，温度在60℃以下能保持稳定；在 pH4．5时嗜杀因子的酶活最高，并且嗜杀因子在pH为3．0到5．0时是稳定的； Ca2+,C02+，K。-,0 M矿对嗜杀因子的活性有激活作用，而Fe2+，F矿，H92+cu2+， Mn2+，7．112+和Ag+对其活性有抑制作用；蛋白抑制剂1，10．菲罗啉，EDTA，SDS， PMSF和碘乙酸对嗜杀因子的B．1，3-D．葡聚糖酶酶活有抑制作用。嗜杀因子的米 氏常数Kin为1．17 mg／ml，Vmax为72．5 v．mol／min．mg：嗜杀因子水解海带多糖的 产物为小分子的糖(单糖和双糖)。 关键词：海洋嗜杀酵母；嗜杀因子；梭子蟹；乳化病；IM，3-D一葡聚糖酶 2 海洋嘈杀酵母的筛选，嗜杀因子的纯化及其萋因的克隆Screening 海洋嘈杀酵母的筛选，嗜杀因子的纯化及其萋因的克隆 Screening for the marine killer yeast against pathogenic yeast in a crab(Portunus trituberculatus)，purification ofthe killer toxin and cloning of the killer toxin gene from the marine killer yeast YF07b Abstract A pathogenic yeast strain WCY which could cause milky disease in Portunus trituberculatus was identified to be Metschnikowia bicuspidate aeeordmg to t