金鱼HSC70和HSP40基因克隆及其原核表达.pdfVIP

南方农业学报 Journal of Southern Agriculture 2018，49（2）：367-374 2期 ·367 · ISSN2095-1191；CODENNNXAAB DO ：10.3969/j.issn.2095-1191.2018.02.25 金鱼HSC 70和HSP40基因克隆及其原核表达 金新萍，谢 倩，吕 斌，曹诣斌* （浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004） 摘要：【目的】克隆金鱼热激同源蛋白70 （HSC 70）和热休克蛋白（HSP40 ）基因，构建原核表达载体并通过IPTG诱 导表达获得目的蛋白，明确HSC70和HSP40蛋白的生物学功能，为揭示金鱼的高温应答机制打下基础。【方法】提取金 鱼鳃组织总RNA ，利用RT-PCR扩增金鱼HSC 70和HSP40基因，将目的基因片段克隆至线性空表达载体pET-32a上构 建原核表达载体pET- 32a-HSC 70和pET- 32a-HSP40 ，转化大肠杆菌Rosetta表达菌株后用IPTG进行诱导表达，并以 SDS和Western blotting检测分析表达获得的融合蛋白。【结果】金鱼HSC 70基因CDS序列全长1950 bp ，编码650 个氨基酸；金鱼HSP40基因CDS序列全长996 bp ，编码332个氨基酸。金鱼HSC70氨基酸序列与斑马鱼、人类、家鼠、 金线鲃和草鱼的相似度分别为96.28%、95.50%、95.35%、98.15%和98.61% ；HSP40氨基酸序列与斑马鱼的完全一致 （相似度100.00% ），与普通鲤鱼、金线鲃、人类和家鼠的相似度均为94.12%。原核诱导表达获得的融合蛋白Trx- HSC70和Trx-HSP40为可溶性表达，其大小约91.5和55.0 kD ，均能与Anti-Trx抗体发生特异性反应。【结论】HSC70和 HSP40蛋白在鱼类及哺乳动物中高度保守，经原核诱导表达获得的金鱼融合蛋白Trx-HSC70和Trx-HSP40为可溶性 表达，且携带有Trx标签，能与Anti-Trx抗体发生特异性反应，可作为互作蛋白用于RNA pull down试验。 关键词：金鱼；HSC 70基因；HSP40基因；克隆；原核表达载体 中图分类号：S965.811 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018 ）02-0367-08 CloningandprokaryoticexpressionofgenesHSC70and HSP40ingoldfish 1 2 3 * JIN Xin-ping ，XIE Qian ，LYU Bin ，CAO Yi-bin （College of Chemistry and Life Science ，Zhejiang Normal University ，Jinhua ，Zhejiang 321004 ，China ） Abstract：【Objective 】Heat shock cognate protein 70 gene （HSC70）and heat shock protein 40 gene （HSP40）of gold- fish were cloned ，their prokaryotic expression vectors were constructed and induced by IPTG to obtain target proteins ，and the bio