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标记抗体的应用 第一节 免疫荧光技术 免疫荧光技术(immunofluorescence technique)是标记免疫技术中发展最早的一种。是将抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏感性和直观性结合起来的一种方法。 (一)直接法 将提纯的抗体球蛋白(主要为IgG)与FITC结合制成荧光抗体。 1、制片： 待检病理组织做成冰冻切片或触片，细菌材料可做成涂片，在室温中自然干燥，病毒抗原通常用冷丙酮固定l5min，细菌抗原则用加热固定即可。 2、染色： 滴加荧光抗体，置37℃染色30～60min，用磷酸缓冲盐水 (PBS)充分洗涤以除去未结合的荧光抗体，加pH9.0缓冲甘油1滴，用盖玻片封固。 3、镜检： 在荧光显微镜下进行检查，抗原所在部位呈黄绿色荧光。 4、设对照： 进行直接荧光染色时，应设以下对照： （1）用荧光抗体染正常组织切片或触片应无荧光； （2）将待检材料先用未标记的抗血清处理，再用荧光抗体染色应不出现荧光。 (二)间接法 先制备荧光标记的抗抗体（第二抗体）。如将提纯的兔抗鸡抗体用荧光素标记，即成兔抗鸡荧光抗体。 1、制片：同直接法 2、染色：染色时，标本先滴加抗血清，在37℃处理30～60min； 用PBS充分洗涤后，再用荧光标记的抗抗体染色，37℃30～60min，洗涤，封固。 3、镜检： 抗抗体必须与抗血清是相应的，如该抗血清是猪源的，则用兔抗猪荧光抗体。 4、对照： 需用正常血清处理作为对照，此对照片应无荧光。 免疫组化法： 用酶代替荧光素标识抗体作生物组织中抗原的鉴定和定位，称为免疫组化法。 酶联免疫吸附测定 (enzyme linked immunosorbent assay)简称ELISA： 用于可溶性抗原或抗体的定量，是一种既特异又敏感的方法。 酶抗体染色法和荧光抗体染色一样，主要有直接法、间接法两种。直接法系用酶标记抗体直接染色，间接法则先用抗血清处理，再用酶标记的抗抗体染色。 酶标记抗体染色通常用冰冻切片，亦可用石蜡切片，用PBS洗净，用直接法或间接法染色，洗去酶标识抗体后，滴加基质反应液显色。常用的反应液为3，3`-二氨基联苯胺(3，3，-diaminobenzlden，简称DAB)溶液 (0.05%于pH2.6Tris盐酸缓冲液中，临用时加入0.02毫升l%H2O2)，洗净后即可在光学显微镜下观察。抗原所在部位呈黄褐。 本法与荧光抗体技术相比，它不需要特殊的荧光显微镜，且形态结构看得清楚，定位比较精确。酶标片子可长期保存，有利于对结果作反复对比，不象荧光抗体片子只能短时间保存。由于酶促反应的产物能产生电子密度的改变，这样就可进一步用电镜作亚细胞结构的定位观察，从而将光学显微水平和电子显微水平衔接起来。 其基本过程是将抗原或抗体吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶试验，底物显色后，用肉眼或分光光度计判定结果，其过程如下。 1.抗原(或抗体)包被： 包被的蛋白质浓度通常为1～10ug/ml，应通过实验选择，最适浓度按所需浓度溶于包被液 (PH9.6，0.05molNa2CO3缓冲液)加入聚苯乙烯滴定板的平底小孔内，4℃过夜，用含助溶剂吐温20(0.05%)的PBS洗涤3次。 2.吸附： 先加入与包被抗体 (或抗原)相对应的被检物，吸附后充分洗涤，再加入与被检物对应的抗抗体 (或其他对应物)，再洗涤，这样可以多层次的叠加，但最后一层必须连接酶，以便与底物作用显色，吸附试验的方法主要有以下几种。 (1)间接法：用于测定抗体。先将抗原被覆，洗涤后加待检血清，充分漂洗后加入酶标记的抗抗体，洗后即可供显色观察。 (2)夹心法：先用抗体(IgG)被覆，加待检抗原，作用洗涤后，加酶标记抗体。 (3)竞争法：用抗体被覆，加一定量的标记抗原和待检抗原混合物，二者竞争与板上的抗体结合，显色后与加未标记抗原的对照组比较，试验孔颜色显著低于对照孔者为阳性孔，待检抗原含量越高，颜色越浅，此法适于小分子抗原或半抗原的检测。 （4）双夹心法，先将抗体被覆，第二层是待检抗原，洗后加酶标记抗抗体。但第三层抗体必须不同于用于被覆的抗体，以避免假阳性。本法适于检查大分子抗原。 (5)酶抗酶抗体法： 将抗原吸附于载体上，然后加待检抗血清，第三层加抗抗体，第四层是抗酶抗体，第五层是酶。其中第二层的抗血清与第四层抗酶抗体必须是同一制备的。这样就可以利用抗抗体搭桥，它的二只手，一手拉住待检抗体，一手拉住抗酶抗体。此法不需事先标记酶，且可事先准备好酶-抗酶抗体复合物，为其优点。 3.底物显色：与免疫酶组化染色法不同，必须用反应后能形成水溶溶性色素的供氢体，常用的有邻苯二胺 (CPD)，联苯茴香胺，5-氨基水杨酸和邻联甲苯胺 。于用前配制避光保存，加入反应