微生物鉴定技术在药品检验与监管中的应用(简版)-徐伟东.pptVIP

同一株菌反复污染洁净环境要引起检验人员高度重视 仅靠洁净室内部消毒措施很可能起不到排除污染的作用 要对洁净室送风系统和检验人员携带污染进行全面调查 建立环境微生物污染趋势分析图，预测微生物污染方向，从被动的排查污染措施上升到主动的预防、预警。将污染信息并与历史污染物比对，回顾调查，帮助质量体系的改进。 微生物进行鉴定菌株来源 共241株 四、微生物鉴定技术平台建设的意义及运用 增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，国际认可，为执法、仲裁提供依据 政府检测实验室、药厂微生物检测实验室洁净环境监控，构建环境微生物分布图，提高检测结果公信力 与国际标准接轨，监控药品生产环境，构建药品生产微生物风险评估体系 应用范围广，扩展能力强，医疗器械、食品、医院等领域广泛运用 4.1 4.2 4.3 4.4 在药品微生物检验中的应用 在严格依据法定方法进行检验的同时，结合微生物鉴定技术平台，对检验过程和检验结果进行双重复合和监控。通过对比环境监测的微生物种群类别和样品微生物种群情况，客观准确的评价检验质量，增菌检验报告的含金量。 在细菌污染检查中的应用 分离纯化得到单菌落 菌落形态检验 DNA提取 构建系统发育树 分子生物学鉴定 通用引物扩增细菌16S rDNA 序列 16S rDNA序列分析 鉴定结论 样品接收 革兰氏染色 API鉴定 形态鉴定 生化鉴定 VITEK鉴定 细菌的鉴定流程图 在真菌污染检查中的应用 DNA测序技术 DNA测序技术可以将生物的遗传信息完整的破译出来，通过直接比较不同类群个体同源核酸的核苷酸排列顺序，获得生物进化、变异的详细信息 如细菌的16S r DNA和真菌的ITS序列，已经被广泛测定应用于菌种鉴定研究之中。由于DNA测序方法耗时短，准确度高，在细菌、真菌、植物、动物的种类鉴定和系统发育研究方面得到了越来越广泛的应用 a) 微生物污染溯源分析 目前微生物分型技术常用于流行病学调查和毒力分析 国际上普遍认同脉冲凝胶电泳技术作为微生物分型的标准方法 现代分子生物学技术可用来区别近缘种，并在研究微生物种内或种组间不同的污染来源及地理亲缘关系的研究中显示出广泛的应用前景 ? b) 相似微生物DNA序列比对和微生物进化分析 根据生物DNA序列的特异性分析，可检测生物基因的微小变化，监控和预测微生物污染的爆发 16S rDNA分型已被广泛认可，微生物16S rDNA进化树对目标微生物进行详细的基因分型，同时还可了解不同来源微生物的进化关系和亲缘关系。该技术应用范围宽，发展前景广，发展潜力巨大 指纹图谱技术 分子杂交技术首先用限制性内切酶对细菌基因组DNA进行酶消化，通过特异性探针与目标DNA序列的杂交结合，经过转膜技术和显色技术形成该细菌特有的杂交图谱。现有成熟的基于16S r DNA的分子杂技图谱库涵盖了200个属的1200多种6950株微生物，为各研究和实验机构提供了一个统一的微生物分型标准。为环境分离物、致病菌、有害生物体、质控菌株、有益生物体和任何细菌建立了一个全自动的基因指纹图库。这一精确到菌株水平的鉴定系统能够追溯细菌污染源，并且具有对所有微生物环境进行控制及流行病学调查等强大功能。 a) 近红外傅立叶光谱分析 b) 色谱分析 物质成分分析 红外傅立叶光谱分析 FT-IR技术以未损伤细胞的FT-IR光谱的特殊指纹区为基础，光谱反映的是整个细胞组成分子的振动特征，也就是蛋白质、核酸等物质的特征 由于这些细胞组分与基因表达有关，反应了全细胞组分的综合信息所得图谱有效地反映了细胞表型和基因型信息，从而区分生化信息上的差别 德国Bruker公司微生物FT-IR分析用户手册主要采用1200-900ｃｍ-1，3000-2800ｃｍ-1，1500-1400ｃｍ-1谱段组合进行微生物判别分析，这3个谱段分别主要代表了微生物细胞壁多聚糖、细胞膜脂肪酸以及细胞质膜蛋白质和类脂成分的信息。 色谱分析 微生物中含有的一些称为生物标志物的化学物质，其含量或结构具有种属特征或与其分类位置密切相关 通过分析微生物的化学组成鉴定微生物，开辟了一个微生物检测和鉴定的新途径 高效液相色谱(High - performance liquid chromatography，HPLC) 气相色谱(Gas chromatography，GC) 气相色谱质谱联用(Gas chromatography - mass spectrometry，GC-MS) 液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS) 建立各种生物标志物在微生物中分布情况的数据库及相应的标准分析程序，仍然是色谱分析微生物的主要方向 2.1 技术手段 2.2 方法比较 各种鉴定方法的比较 我所抗生素室通过比较分析近百种微生物的生化鉴定方法（API和V