利用pHDE-Cas9构建巨桉CTX基因家族CRISPR载体.pdfVIP

南方农业学报 Journal of Southern Agriculture 2018，49（3）：411-417 3期 ·411 · ISSN2095-1191；CODENNNXAAB DO ：10.3969/j.issn.2095-1191.2018.03.01 利用pHDE-Cas9构建巨桉CTX基因家族 CRISPR载体 * 李莉梅，张婷婷，欧阳乐军，陈自银，陈凯钊，刘雅丽，尹爱国，布良灏 （广东石油化工学院 果蔬加工中心，广东 茂名 525000） 摘要：【目的】利用高效基因编辑系统（pHDE-Cas9）构建巨桉细胞分裂素氧化酶/脱氢酶（CTX ）基因家族规律成 簇的间隔短回文重复（CRISPR ）载体，为开展巨桉CTX基因家族功能验证研究打下基础。【方法】设计巨桉CTX基因靶 位点和引物，扩增pCBC质粒上的目的片段，Bsa Ⅰ酶切pHDE载体并与目的片段连接形成重组质粒，转化DH5α感受态 细胞。提取单克隆进行菌液PCR初步验证、重组质粒PCR验证，挑选阳性克隆质粒进行测序分析，构建CTX基因家族 CRISPR载体。【结果】重组质粒PCR鉴定及测序结果表明，重组载体序列无突变，与预期序列高度一致。成功构建了 巨桉CTX基因家族pHDE- CTXA、pHDE-CTXB和pHDE- CTXC同源表达载体。【结论】利用pHDE-Cas9成功构建了巨桉 CTX基因家族CRISPR载体，构建过程快速、高效，为桉树基因组定点编辑打下了基础，也可为其他桉树CRISPR/Cas9表 达载体的构建提供借鉴。 关键词：巨桉；规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）；细胞分裂素氧化酶/脱氢酶（CTX）；载体构建 中图分类号：S792.39 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018 ）03-0411-07 ConstructionofCRISPRvectorofEucalyptusgrandisCTXgene familybypHDE-Cas9 * LI Li-mei ，ZHANG Ting-ting ，OUYANG Le-jun ，CHEN Zi-yin ，CHEN Kai-zhao ， LIU Ya-li ，YIN Ai-guo ，BU Liang-hao （Fruit and Vegetable Processing and Storage Engineering Technology Development Center ，Guangdong University of Petrochemical Technology ，Maoming ，Guangdong 525000 ，China ） Abstract：【Objective 】Interspaced short palindromic repeats （CRISPR/Cas ）vectors of Eucalyptus grandis whose cy- tokinin oxidase/dehydrogenase （CTX ）gene family was regularly clustered were constructed by efficient gene editing sys- tem （pHDE-Cas9）to lay a foundation for verificati